唐 濤，李若萱，李 敏，謝 彤，張美鳳

(1.清華大學醫(yī)院口腔科，北京 100084;2.安貞醫(yī)院口腔科，北京 100029)

慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展與齦下菌斑中微生物的含量、種類、構(gòu)成都密切相關［1］。傳統(tǒng)的潔治、齦下刮治等方法雖能清除齦下菌斑，但對牙周袋內(nèi)的炎癥控制有其局限性，不能終止菌斑內(nèi)致病微生物及其毒性產(chǎn)物的作用。由于全身使用抗生素易出現(xiàn)耐藥和藥物不良反應，現(xiàn)代牙周病治療推崇牙周袋局部用藥的給藥方式。羧甲基殼聚糖作為藥物載體注入到牙周袋內(nèi)，藥物從羧甲基殼聚糖載體中完全釋放的時間應接近于羧甲基殼聚糖載體在牙周袋內(nèi)降解的時間［2］，從而發(fā)揮緩釋作用，具有開發(fā)前景。本試驗將奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠注入牙周袋后觀察主要牙周臨床指標及齦下菌斑微生物學指標的變化，評價奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠在牙周炎輔助治療中作用。

1 臨床資料和方法

1.1 奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠的制備

在凈化臺中稱取羧甲基殼聚糖600 mg經(jīng)Co60消毒后完全溶于30 mL滅菌蒸餾水中，再將奧硝唑450 mg充分溶解處理后，即得含15 g/L奧硝唑與20 g/L羧甲基殼聚糖的奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠。該溶膠呈淡黃透明膠狀，置于棕色容器密閉，4℃保存。

1.2 臨床資料

選擇2011－03—2012－03收治的慢性牙周炎患者65例，納入標準:①3個月內(nèi)未經(jīng)牙周治療且無應用抗生素及避孕藥物史;②無全身性疾病，婦女無妊娠;③口腔存留牙＞20個，且至少有2個重度牙周袋并獨立分布于2個不同的象限作為受檢位點，牙周袋深度(PD)≥4 mm，探診出血(BOP)為陽性。最終納入35～55歲慢性牙周炎患者59例，隨機分為兩組，試驗組28例，受檢位點共56個;其中男18人，女10人，采用奧硝唑羧甲基殼聚糖加基礎治療。對照組31例，受檢位點共62個;其中男19人，女12人，采用牙周基礎治療。

1.3 方法

59例患者治療前用牙周探針采用6點法分別檢查頰或舌側(cè)近中、正中、遠中6個位點?；A治療(齦上潔治和齦下刮治根面平整)后，對照組牙周袋內(nèi)不放藥;試驗組牙周袋注入奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠，每次從袋底開始注入，以注滿牙周袋為準(0.1～0.3 mL)，每7 d復診放藥1次，共4次。分別在治療基線(0 d)后，于7、14、2128 d分別進行4次復診注藥。

1.4 臨床檢查和評價

0、7、14、21、28 d 時進行臨床指標檢查，采集各受檢位點齦下菌斑，記錄菌斑指數(shù)(PLI)、出血指數(shù)(BI)、探診深度(PD)、附著喪失(AL)。為防止臨床檢查對標本采集的影響，臨床指標的檢測與處理均在齦下菌斑采集后完成。

1.5 實驗室指標

1.5.1 齦下菌斑胰蛋白酶樣酶(OD)測定

齦下菌斑標本充分溶于200 μL生理鹽水中，置于震蕩器震蕩30 s備用。為避免菌斑標本之間的相互干擾，每個牙周位點更換一個無菌小環(huán)采集標本。用苯甲酰精氨酸萘酰胺水解試驗(BANA試驗)檢測齦下菌斑胰蛋白酶樣酶，BANA工作液的配制∶44 mg BANA(批號:31K1145，Sigma公司)溶于1 mL二甲亞砜中，配置成100 mmol/L貯存液，4℃保存。使用前用pH 8.5，15 mmol/L TBS緩沖液1∶100稀釋成1 mmol/L的BANA工作液。取1 mmol的BANA 100 μL加入酶聯(lián)反應板孔內(nèi)，然后加入100 μL待檢菌斑標本，37℃孵育過夜。次日酶聯(lián)反應板孔內(nèi)加入0.25%堅牢黑K鹽(Fast Black K，批號:61K2512，Sigma公司)50 μL 呈色，37℃，5 min后觀測結(jié)果。各孔內(nèi)的反應結(jié)果經(jīng)ELISA酶聯(lián)免疫檢測儀測定600 nm波長下的光密度值(OD)。

1.5.2 螺旋體數(shù)目(S%)

臨床所取齦下菌斑立即在滴有2%剛果紅液的干凈載玻片上混合均勻，并涂布成薄層，自然干燥，在盛有濃鹽酸的廣口瓶上熏涂片約1 mm至深藍色后，在光學顯微鏡油鏡(×10000)下觀察，隨機記數(shù)200個微生物，按形態(tài)記數(shù)螺旋體數(shù)目(S%)。

1.6 臨床療效

①痊愈:癥狀基本消失，檢測指標恢復正常;②顯效:癥狀基本消失，BI減少＞2級，PD減少＞1 mm;牙齒松動度明顯改善;③有效:BI減少＞l級，PD減少＞0.5 mm;牙齒松動度稍有改善;④無效:臨床各項指標均無改善，癥狀無任何緩解。

1.7 統(tǒng)計分析

使用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。兩組實驗前后的臨床指標用方差分析。計量數(shù)據(jù)用()表示，經(jīng)成組資料的t檢驗;等級資料(PLI、BI)選用M(QR)方式進行描述(M為中位數(shù)，QR表示四分位數(shù)間距)，組間療效比較均應用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果(表1～2)

表1 治療前后各時間點受檢位點(共118個)臨床指標()

表1 治療前后各時間點受檢位點(共118個)臨床指標()

a.與0 d試驗組比較P＜0.05;b.與0 d對照組比較P＜0.05;c.28 d時與對照組比較P＜0.05

0 d 試驗組 4.48 ±0.360 4.14 ±0.930 5.80 ±0.830 6.23 ±1.490 25.20 ±7.951 0.411 ±0.246對照組 4.20 ±0.380 4.48 ±0.380 5.74 ±0.930 6.52 ±1.010 23.72 ±8.033 0.465 ±0.4367 d 試驗組 1.88 ±0.130a 2.21 ±0.204a 5.81 ±0.503 6.25 ±0.135 10.02 ±8.325a 0.204 ±0.324a對照組 2.54 ±0.520b 2.54 ±0.371b 5.76 ±0.431 6.54 ±0.108 14.56 ±5.897b 0.295 ±0.265b 14d 試驗組 1.24 ±8.650a 1.52 ±0.871a 5.80 ±0.421 6.23 ±0.253 6.82 ±2.467a 0.175 ±0.116a對照組 1.24 ±9.033b 1.72 ±0.561b 5.74 ±0.123 6.51 ±0.114 12.08 ±3.981b 0.271 ±0.323b 21 d 試驗組 0.76 ±9.071a 0.82 ±4.389a 5.83 ±3.162 6.00 ±0.012 4.59 ±4.768a 0.121 ±0.052a對照組 0.92 ±6.490b 1.12 ±5.980b 5.61 ±6.421 6.50 ±0.109 8.34 ±2.324b 0.209 ±0.125b 28 d 試驗組 0.00 ±0.000a 0.08 ±0.020ac 5.78 ±0.863 5.99 ±1.529 2.27 ±1.920ac 0.032 ±0.040ac對照組 0.00 ±0.000b 0.96 ±0.040b 5.52 ±0.740 6.50 ±0.991 4.86 ±1.875b 0.182 ±0.037b

治療前兩組指標(PLI、BI、PD、AL、OD、S%)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明各觀測指標均具有較好的均衡性。

在7、14、21 d時間點，與基線相比，兩組除PD、AL指標差異無統(tǒng)計學意義外(P＞0.05)，其他各項指標較基線有顯著差異(P＜0.05);28 d時兩組相比，PLI、PD和AL差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。兩組相比BI、S%和OD值差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。奧硝唑羧甲基殼聚糖組在降低PLI、BI的程度、減少齦下菌斑螺旋體數(shù)量S%和OD值方面均明顯優(yōu)于對照組(P＜0.05)(圖1～4)。

表2 兩組術(shù)后28 d療效評定 (n，%)

圖1 兩組臨床指標AL，PD，BI，PLI在0～28 d的變化

圖2 兩組S%在0～28 d的變化

圖3 兩組OD值在0～28 d的變化

3 討論

齦下菌斑中細菌及其產(chǎn)物與牙周組織的破壞關系密切，牙周炎的單純機械治療協(xié)同抗菌藥物能有效抑制和殺滅牙周病原菌。與全身應用抗生素相比，局部用藥治療牙周炎效果更好，為使抗菌藥物在牙周袋內(nèi)保持適宜濃度，并維持足夠長的時間，有必要采用局部緩釋系統(tǒng)，以控制藥物濃度的降低［3］。羧甲基殼聚糖具有良好的生物相容性、降解性和細胞黏附性，且無毒、無免疫原性、高安全性，是良好的藥物載體，對臨床上一些特殊牙周炎的治療起到很好的輔助作用［4］。Tarsi等［5］發(fā)現(xiàn)，殼聚糖在口腔黏膜的附著時間可大于4 d。奧硝唑是一種窄譜抗菌素［6］，有效殺滅專性厭氧菌，而專性厭氧菌是慢性牙周炎發(fā)病初期和進展期中主要病原體。本藥物治療方案與耿素芳等研究“鹽酸米諾四環(huán)素軟膏對齦溝液中膠原酶的影響”［7］相一致，即用藥方法注滿受試牙牙周袋，1次/周，共4次。奧硝唑用藥時間較長可能引致菌群失調(diào)，本實驗未做設置監(jiān)測耐藥菌株的指標，有待進一步研究。

有研究表明，慢性牙周炎患者的絕大部分位點，通過機械治療和定期維護可處于靜止狀態(tài)，因為牙周機械治療后牙周炎位點和健康位點齦上、齦下菌群中各種細菌的數(shù)量都明顯下降［8］，臨床癥狀明顯好轉(zhuǎn)，牙周臨床指標均有不同程度下降。本結(jié)果顯示，試驗組和對照組除 PD、AL外，PLI、BI、S%、OD 值均在治療后的 7、14、21、28 d 比牙周基礎治療(0 d)降低，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。與周婷等報道基本一致［9］。

大量試驗表明，牙周潔治和齦下刮治后數(shù)分鐘到數(shù)10 d牙周袋內(nèi)即有殘余細菌的再定植和繁殖，所以如不繼續(xù)干預，在治療后數(shù)周內(nèi)細菌又可達到治療前的有害水平［10］。Loesche的研究表明健康齦下螺旋體不超過1.8%，在深牙周袋中螺旋體和G－桿菌比例增加，螺旋體可高達近40%。螺旋體為G－菌，常與牙齦卟啉單胞菌、梭形桿菌等厭氧菌呈現(xiàn)混合感染，多在深牙周袋檢出［11］。奧硝唑羧甲基殼聚糖聯(lián)合應用抑菌性能增強并有緩釋作用，對口腔重要厭氧菌具有較明顯的抑菌作用和良好的生物相容性［12］。刮治后牙周袋內(nèi)注入奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠，維持袋內(nèi)有效藥物濃度，發(fā)揮其較強的殺滅厭氧菌的功效［13］。本結(jié)果顯示，S%在7 d試驗組與對照組均下降最快，之后平穩(wěn)下降。在7、14、21 d試驗組和對照組各項牙周指標比較差異無顯著性(P＞0.05);而在28 d，BI、S%和OD值差異有顯著性(P＜0.05)，表明隨著細菌的繼續(xù)定殖，奧硝唑的優(yōu)勢顯現(xiàn)出來。

BANA試驗OD值作為牙周炎輔助診治的客觀指標之一［14］，具有簡便、快捷、敏感、特異性強等優(yōu)點，在確立牙周炎的嚴重程度和療效觀察，指導臨床用藥上有其重要意義。BANA試驗是利用與牙周炎密切相關的病源微生物［牙齦卟啉單胞菌、齒密螺旋體、福塞氏類桿菌等能產(chǎn)生胰蛋白酶樣酶(TLE)，可使人工合成的酶底物—苯甲酰精氨酸萘酰胺(BANA)水解］建立的快速檢測這些細菌的方法。TLE的監(jiān)測有助于了解牙周病變的程度［15］，隨著牙周齦下病源微生物量的增加，TLE活性的增強，臨床檢查的各指數(shù)均呈明顯的上升趨勢［16］。TLE具有蛋白水解酶和對成纖維細胞的抑制作用，對局部組織不斷溶解、破壞導致血管通透性的增加，影響牙周袋上皮的完整性、連續(xù)性，是牙周組織破壞的重要因素之一［17］。本結(jié)果顯示，在牙周上藥14 d前OD值兩組下降一致，28 d時試驗組OD值下降較對照組快，說明奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠配合基礎治療，OD值明顯減少齦下菌斑TLE水平優(yōu)先于對照組。

PD、AL可客觀反映牙周組織破壞程度，本試驗PD、AL在均值上略有改變，但無顯著性，可能是由于牙周袋和附著水平在28 d短時間內(nèi)變化不大所導致。

本結(jié)果證實了慢性牙周炎是一種由多種致病菌引起的慢性感染性疾病，用藥后28 d試驗組較對照組牙周臨床指標有明顯改善，但齦下菌斑中牙周致病菌卻有反彈，用藥后BANA試驗OD值改變顯著，因此，齦下致病菌TLE水平量的變化早于臨床指標的變化。提示BANA試驗OD值可以作為反映牙周治療效果的指標，刮治后注入奧硝唑羧甲基殼聚糖溶膠較基礎治療在控制齦下菌斑有害微生物的作用更具優(yōu)勢。

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