動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者血漿抗凝血酶Ⅲ的變化及其機(jī)制*

林旭紅， 魏丹丹， 王慧超， 徐 靜， 王見(jiàn)濤，白春洋， 王亞強(qiáng)， 趙耀亭， 李倩一， 任學(xué)群

腦梗死又稱缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)，是指急性起病迅速出現(xiàn)的腦組織因缺血、缺氧而發(fā)生的局限性或彌漫性腦功能缺損征象的血管性事件，其導(dǎo)致的死亡率居全球第三［1］。腦梗死的主要病理是由于供應(yīng)腦部血液的動(dòng)脈出現(xiàn)粥樣硬化和血栓形成，使管腔狹窄甚至閉塞，導(dǎo)致局灶性急性腦供血不足而發(fā)病。腦卒中以其高發(fā)病率、高病死率、高致殘率而構(gòu)成對(duì)人類健康的巨大威脅，因此探討其發(fā)病機(jī)制對(duì)防治腦血管病具有重大社會(huì)意義。本研究通過(guò)檢測(cè)55例腦梗死患者血漿抗凝血酶Ⅲ(antithrombinⅢ，AT-Ⅲ)水平，探討其與腦動(dòng)脈血栓形成的關(guān)系，以及AT-Ⅲ在腦動(dòng)脈血栓形成中變化的機(jī)制，為腦卒中的防治提供有意義的理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1 研究對(duì)象與分組

病例來(lái)自2012年11月～2013年4月河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院患者。實(shí)驗(yàn)組55例，其中男35例，女20例，年齡30～82歲，平均年齡(64.2±11.3)歲。符合1995年第四屆全國(guó)腦血管病會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)頭部CT或MRI證實(shí)，并且經(jīng)TCD(經(jīng)顱彩色多普勒超聲)及頸部CDFI(頸部彩色多普勒超聲)證實(shí)除外血管狹窄及硬化;同時(shí)符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表積分(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)＞2，從癥狀發(fā)生到血標(biāo)本收集時(shí)間間隔≤48 h?；颊呱砉δ芗吧窠?jīng)損傷程度根據(jù)NIHSS［2］評(píng)估，分值越大，卒中程度越重。另選我院同期健康體檢者55例為正常對(duì)照組，其中男30例，女25例，年齡28～77歲，平均年齡(62.3±5.8)歲，與實(shí)驗(yàn)組相匹配，見(jiàn)表1。所有病例均除外3個(gè)月內(nèi)手術(shù)史、外傷、急慢性肝病、血液系統(tǒng)疾病、腎病綜合征、急慢性炎癥疾病及口服避孕藥等情況。

2 方法

2.1 標(biāo)本采集和制備 受試者于入院次日晨空腹抽靜脈血，部分全血用于分離、鑒定、培養(yǎng)單核細(xì)胞，取3.6 mL加入0.109 mmol/L枸櫞酸鈉0.4 mL抗凝

表1 試驗(yàn)組與對(duì)照組一般情況比較Table 1.Comparison of the general clinical data(Mean±SD.n=55)

試管中，3 000 r/min離心10 min，上層血漿測(cè)定AT-Ⅲ活性;另取肝素抗凝血血漿，分成3份備用，分別測(cè)定免疫復(fù)合物、常規(guī)生化項(xiàng)目及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素 6(interleukin 6，IL-6)水平;EDTA抗凝血分離單核細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。對(duì)照組空腹采集肘靜脈血，標(biāo)本處理與試驗(yàn)組相同。

2.2 發(fā)色動(dòng)物法測(cè)定AT-Ⅲ活性 應(yīng)用STAGO-R Evolution全自動(dòng)血凝儀以發(fā)色動(dòng)物法直接上機(jī)測(cè)定血漿AT-Ⅲ活性，試劑為配套 AT-Ⅲ試劑1(凝血酶)、2(底物)和3(凝血酶溶劑)。

2.3 常規(guī)生化項(xiàng)目的檢測(cè) 用Olympus 2700全自動(dòng)生化分析儀對(duì)所有肝素抗凝血血漿進(jìn)行常規(guī)生化項(xiàng)目的測(cè)定，包括空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和同型半胱氨酸。

2.4 循環(huán)免疫復(fù)合物水平測(cè)定 參照Thomas等［3］的方法，根據(jù)說(shuō)明書操作，應(yīng)用商業(yè)化MicroVue CICRaji Cell Replacement EIA kit(Quidel)試劑盒測(cè)定血漿循環(huán)免疫復(fù)合物水平，每個(gè)樣本重復(fù)2次，求均值。

2.5 血漿TNF-α和IL-6水平 另1份肝素抗凝血漿置于-80℃冰箱中保存，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(Sigma)進(jìn)行血漿TNF-α和IL-6水平測(cè)定，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。

2.6 外周血單核細(xì)胞分離 參照姚婷等［4］的方法，分離外周血單核細(xì)胞，即全血經(jīng)Hanks液稀釋1倍后用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離，取單個(gè)核細(xì)胞層，Hanks液洗滌3次后，用10% 牛血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1010/L。將該濃度的外周血單個(gè)核細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200 μL，置CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，以使單個(gè)核細(xì)胞充分貼壁;用溫Hanks液洗滌3次，去除非黏附細(xì)胞，貼壁的即為單核細(xì)胞。經(jīng)CD14單克隆熒光抗體染色后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，證實(shí)所得細(xì)胞80% 以上為單核細(xì)胞。

2.7 單核細(xì)胞數(shù)量及表型測(cè)定 獲取培養(yǎng)好的單核細(xì)胞，用分離緩沖液(PBS;20 mmol/L HEPES，pH 7.4;10 mmol/L EDTA;0.5%BSA)準(zhǔn)備單細(xì)胞懸液，劇烈吹打。洗完后分別與 CD14、CD16、CD32、CD64抗體孵育，固定于1%多聚甲醛。參照 Scaldaferri等［5］的方法，用Coulter Epics XL流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)測(cè)定單核細(xì)胞數(shù)量及表型，進(jìn)行定量流式細(xì)胞分析。細(xì)胞表面分子表達(dá)定量采用WinList 5.0軟件分析。

2.8 免疫復(fù)合物刺激對(duì)外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-6分泌的影響 參照Prehn等［6］的方法，制備板固定交聯(lián)人類IgG(復(fù)合IgG)，即12孔板中每孔加入1 mL溶于PBS(0.5 g/L)中的人類IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)共孵育過(guò)夜，PBS洗，與750 μL溶于 PBS(20 mg/L)中的小鼠抗人 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)共孵育1 h。包被好的孔板在加入細(xì)胞之前用PBS洗。將分離好的單核細(xì)胞用加入含有不同濃度(0.1～1 000 mg/L)Ig-IC復(fù)合物的12孔板刺激18 h，收集細(xì)胞上清，ELISA法測(cè)定上清液中TNF-α和IL-6水平?？扇苄匀祟怚gG(hIgG)作為對(duì)照。

2.9 TNF-α和IL-6對(duì)人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞AT-Ⅲ表達(dá)的影響 人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞(human brain vascular endothelial cells，HBVECs;源于胎腦血管，ScienCell提供)復(fù)蘇后置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，貼壁后以5 mL 0.25%胰酶消化，并加入約10 mL胰蛋白酶中和液，用滴管吹打，使細(xì)胞全部脫離培養(yǎng)瓶壁，1 000 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞，進(jìn)行分裝傳代。將傳至4代的HBVECs分別接種于60 mm培養(yǎng)皿和6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至60% ～70%融合時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS清洗3遍后，加入TNF-α或IL-6刺激24 h，培養(yǎng)結(jié)束后離心取細(xì)胞上清液，參照Li等［7］的方法，用Western blotting法測(cè)定上清中AT-Ⅲ蛋白表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多元線性相關(guān)分析用來(lái)評(píng)價(jià)血漿AT-Ⅲ活性與神經(jīng)損傷程度、腦血管病危險(xiǎn)因素(血壓、空腹血糖及血脂、同型半胱氨酸等)的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 血漿AT-Ⅲ活性的變化

如圖1所示，與對(duì)照組［(97.10±11.63)%］相比，實(shí)驗(yàn)組血漿 AT-Ⅲ活性明顯降低(84.96±10.37)%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Figure 1.Comparison of AT-Ⅲactivity in the plasma between clinical trial group and control group.Mean±SD.n=55.*P＜0.05 vs control group.圖1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血漿AT-Ⅲ活性比較

2 血漿AT-Ⅲ活性與神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷及腦梗死危險(xiǎn)因素的相關(guān)性分析

將神經(jīng)功能損傷積分、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、同型半胱氨酸作為自變量，將血漿AT-Ⅲ活性作為應(yīng)變量，進(jìn)行多元線性相關(guān)分析，研究發(fā)現(xiàn)腦梗死患者血漿AT-Ⅲ活性與神經(jīng)功能損傷程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.53，P ＜0.05)，與收縮壓(r=-0.18)、舒張壓(r=-0.35)、空腹血糖(r=-0.29)、膽固醇(r=-0.79)、甘油三酯(r=-0.61)、低密度脂蛋白(r=-0.75)、同型半胱氨酸(r=-0.80)呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，與高密度脂蛋白呈正相關(guān)(r=0.45，P ＜0.05)。

3 血漿TNF-α和IL-6水平的變化

與對(duì)照組［TNF-α(100.00±34.29)%和 IL-6(100.00±46.15)%］比較，實(shí)驗(yàn)組的TNF-α和IL-6水平分別為(1 022.98±115.09)%和(505.20±57.57)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

4 血漿免疫復(fù)合物水平的變化

如圖3所示，與對(duì)照組［(8.9±1.5)Eq/L］比較，實(shí)驗(yàn)組免疫復(fù)合物水平明顯升高［(25.3±3.9)Eq/L，P ＜0.01］。

Figure 2.Comparison of TNF-α (A)and IL-6(B)levels in the plasma between clinical trial group and control group.Mean±SD.n=55. ＊＊P ＜0.01 vs control group.圖2 試驗(yàn)組與對(duì)照組血漿TNF-α和IL-6水平比較

Figure 3.Comparison of immunocomplex level in the plasma between clinical trial group and control group.Mean±SD.n=55.＊＊P＜0.01 vs control group.圖3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組血漿免疫復(fù)合物水平比較

5 外周血單核細(xì)胞表面標(biāo)志物的變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組外周血CD14+CD16+單核細(xì)胞的百分比為(0.63±0.15)%，CD14+CD32+單核細(xì)胞為(5.32±0.98)%，CD14+CD64+單核細(xì)胞為(4.81±0.76)%，實(shí)驗(yàn)組三者比例分別為(0.71±0.19)%、(5.51±0.27)% 和(8.79±0.42)%，其中CD14+CD64+的單核細(xì)胞比例與對(duì)照組比較明顯升高，差異顯著(P＜0.05)，而CD14+CD16+和 CD14+CD32+單核細(xì)胞無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖 4、5。

6 免疫復(fù)合物刺激對(duì)外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-6分泌的影響

與對(duì)照組比較，經(jīng)免疫復(fù)合物刺激后，外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-6的分泌水平均呈濃度依賴性明顯升高，在1 000 mg/L hIgG時(shí)分別達(dá)到3 700 ng/L和1 100 ng/L(P ＜0.01)，見(jiàn)圖6。

Figure 4.Isolation and identification of monocytes in the peri-pheral blood.Left:negative control;right:CD14+cells.圖4 外周血單核細(xì)胞的分離和鑒定

Figure 5.Comparison of the monocyte surface markers in the peripheral blood between clinical trial group and control group.Mean±SD.n=55.*P＜0.05 vs control group.圖5 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組外周血單核細(xì)胞表面標(biāo)志物比較

Figure 6.The levels of TNF-α (A)and IL-6(B)induced by stimulation of immunocomplex in the peripheral blood.Mean±SD.n=55.＊＊P＜0.01 vs control group.圖6 免疫復(fù)合物刺激對(duì)外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-6分泌的影響

7 TNF-α和IL-6對(duì)人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞AT-Ⅲ表達(dá)的影響

由圖7可知，與TNF-α或IL-6共孵育后，HBVECs AT-Ⅲ蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(P＜0.05或P＜0.01)。

Figure 7.The effects of TNF-α (A)and IL-6(B)on the expression of AT-Ⅲ in human brain vascular endothelial cells.Mean ±SD.n=10.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖7 TNF-α和IL-6對(duì)人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞AT-Ⅲ表達(dá)的影響

討 論

動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病機(jī)理主要是血管病變基礎(chǔ)上，內(nèi)膜損傷破裂形成潰瘍后，血小板等血中有形成份黏附、聚集并釋放更多促凝血因子，同時(shí)血液成分中脂蛋白、膽固醇、纖維蛋白原等含量增加，使血黏度增高，血流緩慢、凝固性增高，局部腦組織出現(xiàn)急性缺血癥狀。因此動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生與凝血和抗凝系統(tǒng)的失衡有關(guān)，而對(duì)凝血系統(tǒng)起制約作用的抗凝系統(tǒng)在動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病中有重要意義。

AT-Ⅲ是主要由肝臟合成的單鏈糖蛋白，并作為絲氨酸蛋白酶抑制物，作用于諸多凝血因子含絲氨酸殘基的活性中心，為血漿生理性抑制凝血的關(guān)鍵物質(zhì)，參與保持體內(nèi)抗凝血功能和纖溶系統(tǒng)與凝血系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡［8］，正常情況下約占血漿總抗凝血酶活性的50% ～70%［9］。當(dāng)血漿中AT-Ⅲ活性小于70%時(shí)，血栓形成的危險(xiǎn)性就會(huì)增加。有報(bào)道指出，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化可使血管內(nèi)皮細(xì)胞大量受損，故必累及抗凝因子，而其中以抗凝物質(zhì)減低居多［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相似，動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者急性期AT-Ⅲ活性明顯降低，可能與凝血酶大量活化，凝血功能亢進(jìn)消耗有關(guān)，加之長(zhǎng)期的動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等危險(xiǎn)因素，使血管內(nèi)皮細(xì)胞不同程度的受損，抗凝因子合成減少，故AT-Ⅲ活性的下降與消耗及合成減少有關(guān)。這一結(jié)果與最近一項(xiàng)早期應(yīng)用AT-Ⅲ可降低小鼠腦缺血程度、保護(hù)腦神經(jīng)的研究［11］結(jié)果一致;而且血漿AT-Ⅲ活性與腦梗死危險(xiǎn)因素相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血漿AT-Ⅲ活性與收縮壓、舒張壓、空腹血糖、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、同型半胱氨酸呈負(fù)相關(guān)，與高密度脂蛋白呈正相關(guān)。分析其中原因可能為高血壓可以導(dǎo)致小動(dòng)脈的損傷，高血糖、高膽固醇、高甘油三酯和低密度脂蛋白伴隨的動(dòng)脈粥樣硬化也會(huì)損傷小血管。因此，AT-Ⅲ可能是動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的危險(xiǎn)因子，它反映了動(dòng)脈粥樣硬化的程度和其它原因(高血壓等)所致的小血管損傷。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者神經(jīng)損傷程度與AT-Ⅲ活性也呈負(fù)相關(guān)，檢測(cè)AT-Ⅲ活性，可有助于病情監(jiān)測(cè)及指導(dǎo)臨床治療。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，炎癥和凝血兩大系統(tǒng)間存在很強(qiáng)的相互作用和廣泛的交互通話［12］，其中促炎細(xì)胞因子是最重要的連接炎癥和凝血的橋梁。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生，主要和局部炎癥有關(guān)，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了其在炎癥誘導(dǎo)凝血激活的過(guò)程中的重要核心地位:將TNF-α注入人體后檢測(cè)多種凝血指標(biāo)，結(jié)果顯示凝血途徑被激活［13］。IL-6是一種也可以激活凝血系統(tǒng)的促炎細(xì)胞因子［14］，抗IL-6的抗體可以阻止系統(tǒng)感染導(dǎo)致的凝血異常［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，血漿中的TNF-α和IL-6水平在試驗(yàn)組明顯升高，可能是由于局部不穩(wěn)定斑塊中升高的TNF-α和IL-6表達(dá)水平導(dǎo)致血漿的TNF-α和IL-6水平升高［16］，也可能是由血液中某些細(xì)胞直接產(chǎn)生，提示這些促炎細(xì)胞因子水平的升高可能與降低的AT-Ⅲ活性有關(guān)。

炎癥過(guò)程和免疫反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的核心病理過(guò)程［17-18］。組織病理學(xué)結(jié)果進(jìn)一步顯示:斑塊中單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的激活和復(fù)雜相互作用，在動(dòng)脈粥樣硬化和斑塊不穩(wěn)定相關(guān)的炎癥過(guò)程中發(fā)揮重要作用［19］，這種復(fù)雜的作用最終引起動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和急性冠脈綜合征。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，血漿病理產(chǎn)物免疫復(fù)合物水平也明顯升高，為了進(jìn)一步闡明免疫復(fù)合物和細(xì)胞因子在動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者AT-Ⅲ活性變化中的關(guān)系及其機(jī)制，我們分離外周血單核細(xì)胞并對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD14+CD16+單核細(xì)胞和CD14+CD32+單核細(xì)胞數(shù)量在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯差別，而實(shí)驗(yàn)組CD14+CD64+單核細(xì)胞數(shù)量明顯升高，因此我們推測(cè)在腦梗死患者，免疫復(fù)合物可能通過(guò)結(jié)合CD14+CD64+的單核細(xì)胞，刺激其產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致AT-Ⅲ活性改變。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述假設(shè)，深入探討AT-Ⅲ在腦梗死患者變化的機(jī)制，我們?cè)隗w外模擬免疫復(fù)合物，并觀察其對(duì)外周血單核細(xì)胞TNF-α和IL-6分泌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)免疫復(fù)合物刺激后，這些促炎細(xì)胞因子的水平均明顯升高，通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)TNF-α和IL-6對(duì)人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞AT-Ⅲ表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)二者均能抑制AT-Ⅲ表達(dá)。因此，我們認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者升高的促炎細(xì)胞因子主要來(lái)源于血液中受刺激的的單核細(xì)胞，這些細(xì)胞因子使血管內(nèi)皮細(xì)胞不同程度的受損，抗凝因子合成減少，可能是血漿AT-Ⅲ活性下降的主要原因。

綜上所述，AT-Ⅲ活性在動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者血漿中明顯降低，是腦梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，其可能的機(jī)制是免疫復(fù)合物通過(guò)CD14+CD64+單核細(xì)胞介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，并進(jìn)一步損傷腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制AT-Ⅲ合成。因此，升高AT-Ⅲ活性對(duì)缺血腦組織具有保護(hù)作用。

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