黃雪瓊， 檀衛(wèi)平， 吳葆菁， 藍(lán) 丹， 吳海飛， 麥賢弟

哮喘是兒童常見的氣道慢性炎癥性疾病。以吸入性糖皮質(zhì)激素或聯(lián)合β2受體激動(dòng)劑的傳統(tǒng)手段能較好控制大多數(shù)輕中度哮喘患者。而對(duì)于部分重癥患者，規(guī)范抗哮喘治療仍難以達(dá)到良好療效，其急診就診率和住院率分別為輕、中度哮喘患者的15倍和20倍，是增加哮喘治療費(fèi)用的重要原因之一［1］。輔助性T細(xì)胞17(T helper 17 cells，Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)失衡被證實(shí)在重度哮喘發(fā)病過程中起重要作用［2-3］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為多能干細(xì)胞，具有多向分化性、高度增殖性、低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)活性，成為近年來肺部疾病細(xì)胞治療的研究熱點(diǎn)［4］。本研究通過建立MSCs與重癥哮喘患兒外周血T淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系，探討MSCs對(duì)Th17和Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，從而為以MSCs為基礎(chǔ)的哮喘防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 研究對(duì)象

入選病例為2012年10月～2013年10月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院兒科哮喘?？崎T診急性發(fā)作期重度哮喘兒童20例，診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組修訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。樣本采集均取得患兒家屬或法定監(jiān)護(hù)人的同意(簽署知情同意書并取得倫理委員會(huì)的同意)。

2 試劑及儀器設(shè)備

白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)和腫瘤轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor β，TGF β)ELISA試劑盒，購自武漢華美科技有限公司;Trizol試劑盒購自TaKaRa;ABI MultiScribeTMReverse Transcriptase試劑盒和Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒均購自ABI;所有引物均由生工生物工程有限公司合成。ABI Cycler PCR儀;ABI Step One RT-PCR儀。

3 主要方法

3.1 骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 肝素抗凝的健康成人骨髓10 mL，用等體積含15% 胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)的L-DMEM培養(yǎng)液稀釋吹打混勻，接種于25 cm2塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。第3～5天首次換液，此后每3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%融合單層后傳代，細(xì)胞傳代用含10%FCS的L-DMEM培養(yǎng)液。

取第3代和第5代 MSCs，以0.25%胰酶(含0.02%EDTA)消化成單細(xì)胞懸液，以PBS緩沖液洗滌3遍，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L，分別加入光標(biāo)記的抗體:anti-CD34-FITC、anti-CD45-FITC、anti-CD29-PE和anti-CD105-FITC，振蕩混勻后室溫下避光孵育15 min，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析樣本中細(xì)胞相應(yīng)標(biāo)記抗原的陽性表達(dá)率。

3.2 外周血T淋巴細(xì)胞(T lymphocytes，TLC)的分離及培養(yǎng) 抽取入選研究對(duì)象的外周靜脈血4 mL(EDTA抗凝)，PBS等體積稀釋，緩慢加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上，2 500 r/min離心20 min;吸取中間白膜層，以PBS充分洗滌后，以2 000 r/min離心10 min，棄去上清后，加入RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×109/L。37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)3 h后，吸取懸浮細(xì)胞為TLC。

3.3 CCK-8法檢測MSCs對(duì)TLC增殖的影響 第3 ～5代的 MSCs經(jīng)消化、計(jì)數(shù)后，按100 μL/well接種于96孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，72 h待其貼壁后，經(jīng)絲裂霉素C(25 μg/L)孵育30 min后，換為常規(guī)培養(yǎng)液;實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組:陰性對(duì)照組:TLC以2×105/L單獨(dú)培養(yǎng)，未予植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)刺激;陽性對(duì)照組:等量 TLC經(jīng) PHA刺激轉(zhuǎn)化(50 μg/L);MSCs組:按每孔2 ×104、1 ×104、2 ×103和1×103個(gè)細(xì)胞密度接種MSCs于96孔板內(nèi);實(shí)驗(yàn)組:PHA 刺激下 MSCs與 TLC 按不同比例(1∶1、1∶2、1∶10和1∶20)直接接觸共培養(yǎng)。72 h后加入CCK-8 10 μL/well，繼續(xù)孵育 2 h，在 450 nm 波長處，酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度(A)值，并計(jì)算TLC增殖抑制率:1-(共培養(yǎng)組A值-MSCs組A值)/陽性對(duì)照組A值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.4 ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-17和TGF-β的含量 收集1∶2比例共培養(yǎng)體系培養(yǎng)上清及TLC單獨(dú)培養(yǎng)上清，按IL-17和TGF-β定量檢測試劑盒操作，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)2個(gè)復(fù)孔，記錄酶標(biāo)儀492 nm處數(shù)據(jù)。

3.5 qRT-PCR檢測維甲酸相關(guān)孤兒核受體(retinoic acid-related orphan nuclear receptor C，RORC)及叉頭框蛋白3(forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3)mRNA表達(dá)收集1∶2比例共培養(yǎng)體中懸浮細(xì)胞及TLC單獨(dú)培養(yǎng)細(xì)胞，采用Trizol法提取RNA，ABI Script RT Kit合成cDNA，引物序列見表1。根據(jù)Real Master Mix(含SYBR Green I)配置PCR反應(yīng)體系，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，設(shè)定最佳閾值，獲取擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和斜率，用公式2-ΔΔCt方法進(jìn)行相對(duì)定量，計(jì)算得出目的基因相對(duì)于管家基因GAPDH的量。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件處理，正態(tài)分布定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MSCs的形態(tài)和表型

傳代培養(yǎng)的MSCs為成纖維細(xì)胞樣，形態(tài)均一、旋渦狀生長。流式細(xì)胞儀檢測第3和5代MSCs表面分子，絕大部分細(xì)胞均表達(dá)CD29和CD105，不表達(dá) CD34 和 CD45，見圖 1、2。

Figure 1.The 3rd passage of MSCs.A:×40;B:×100.圖1 第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

Figure 2.Surface markers of CD29，CD105，CD45 and CD34 in MSCs.圖2MSCs表型鑒定CD29、CD105、CD45及CD34

2 MSCs對(duì)TLC體外誘導(dǎo)增殖的影響

PHA刺激下MSCs與TLC共培養(yǎng)72 h，顯微鏡下觀察到共培養(yǎng)組TLC生長稀疏，增殖受限，見圖3。CCK-8法結(jié)果提示:4組不同濃度MSCs對(duì)TLC增殖的抑制具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著MSCs濃度的增高，其抑制能力逐步增強(qiáng)，見表2。

Figure 3.MSCs cocultured with TLC.A:×40;B:×100.圖3MSCs與TLC共培養(yǎng)

3 MSCs對(duì)重度哮喘患兒外周血IL-17及TGF-β表達(dá)水平的影響

MSCs+TLC共培養(yǎng)組IL-17表達(dá)水平較TLC單獨(dú)培養(yǎng)組降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而共培養(yǎng)后TGF-β表達(dá)水平明顯升高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表3。

4M SCs對(duì)重度哮喘患兒外周血RORC mRNA及Foxp3 mRNA表達(dá)水平的影響

MSCs+TLC共培養(yǎng)組RORC mRNA表達(dá)水平較TLC單獨(dú)培養(yǎng)組明顯減低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);共培養(yǎng)組Foxp3 mRNA表達(dá)與TLC單獨(dú)培養(yǎng)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表4。

討 論

重度哮喘是一種免疫紊亂的變態(tài)反應(yīng)性疾病，常表現(xiàn)為持續(xù)性氣道炎癥、氣道重塑及糖皮質(zhì)激素抵抗性，常規(guī)治療效果欠佳。近年來，淋巴細(xì)胞亞群Th17/Treg失衡作為重度哮喘發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)受到廣泛關(guān)注。課題組以往資料顯示，重度哮喘患兒體內(nèi)Th17細(xì)胞過度活化，占優(yōu)勢(shì)地位，而Treg細(xì)胞數(shù)目相對(duì)減少及功能低下導(dǎo)致Th17/Treg失衡，加重哮喘的發(fā)生發(fā)展，與哮喘氣道重塑密切相關(guān)［6-7］。 Th17與Treg細(xì)胞的分化成熟分別受其上游轉(zhuǎn)錄因子RORC及Foxp3表達(dá)水平調(diào)控，而IL-17與TGF-β則分別是二者重要的效應(yīng)因子。通過調(diào)控Th17/Treg之間的平衡，恢復(fù)免疫自穩(wěn)狀態(tài)，緩解炎癥反應(yīng)，將為哮喘的治療提供新思路。

表2 MSCs對(duì)PHA刺激下TLC增殖的影響Table 2.Effect of MSCs on the proliferation of T lymphocytes(TLC)stimulated by PHA(Mean±SD.n=9)

表3 2組培養(yǎng)上清IL-17及TGF-β的分泌情況Table 3.Secretion of IL-17 and TGF-β in supernatants of the 2 groups(ng/L.Mean±SD.n=20)

表4 重度哮喘患兒外周血RORC及Foxp3 mRNA表達(dá)Table 4.The mRNA expression of RORC and Foxp3 in children with severe bronchial asthma(Mean±SD.n=20)

MSCs廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，具有強(qiáng)大的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，被廣泛應(yīng)用于炎癥性疾病和自身免疫疾病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究中［8-10］。本實(shí)驗(yàn)通過MSCs與重度哮喘患兒外周血TLC的共培養(yǎng)，探討MSCs對(duì)Th17和Treg細(xì)胞效應(yīng)因子IL-17、TGF-β 及轉(zhuǎn)錄因子 RORC、Foxp3 mRNA表達(dá)的影響。

近年研究表明，MSCs在體外能夠有效抑制TLC的增殖反應(yīng)。Djouad等［11］證實(shí)MSCs能明顯抑制共培養(yǎng)體系中TLC的增殖活性，且在一定濃度范圍內(nèi)呈量效和時(shí)效正比關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MSCs對(duì)PHA刺激下重度哮喘患兒外周血TLC增殖具有顯著抑制作用，且隨著MSCs數(shù)量的增加，抑制作用也同步增強(qiáng)，具有一定的劑量依賴性，與大多數(shù)研究相符合。

以往研究顯示，MSCs在不同體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)TLC的免疫調(diào)節(jié)作用不盡相同。Ghannam等［12］研究發(fā)現(xiàn)MSCs不僅能抑制原始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞方向分化，減少IL-17和IL-22水平，并且通過誘導(dǎo)Foxp3的轉(zhuǎn)錄增加Treg細(xì)胞數(shù)量，從而發(fā)揮抗炎作用。而 Kapoor等［13］將過敏性哮喘患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞給予螨蟲致敏后，與MSCs共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSCs減少IFN-γ、上調(diào)IL-10水平的同時(shí)，Treg細(xì)胞數(shù)量沒有明顯改變，成熟樹突狀細(xì)胞反而明顯增加，提示MSCs可能通過促進(jìn)成熟樹突狀細(xì)胞而非Treg細(xì)胞的生成達(dá)到抗炎效果。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MSCs與PHA刺激下重度哮喘患兒外周血TLC直接接觸共培養(yǎng)后，Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子RORC mRNA和效應(yīng)因子IL-17均表達(dá)減少，提示MSCs可能通過抑制Th17細(xì)胞定向分化并下調(diào)IL-17的分泌，進(jìn)而減少重度哮喘患兒體內(nèi)的中性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)。另外我們還發(fā)現(xiàn)，MSCs上調(diào)TGF-β水平的同時(shí)，對(duì)Treg細(xì)胞調(diào)控基因Foxp3 mRNA表達(dá)并無明顯影響，證實(shí)了TGF-β是MSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要因子。本研究顯示，MSCs對(duì)重度哮喘患兒的免疫調(diào)節(jié)作用并非通過上調(diào)Treg細(xì)胞的定向分化，可能通過高分泌TGF-β來抑制T、B淋巴細(xì)胞的增殖及巨噬細(xì)胞的活化，抑制CD4+T細(xì)胞亞群向Th17方向極化，從而糾正Th17/Treg失衡。

［1］ Polosa R，Beneath GT.Managing patients with chronic severe asthma:Rise to the challenge［J］.Eur J Intern Med，2009，20(2):114-124.

［2］ Al-Ramli W，Préfontaine D，Chouiali F，et al.TH17-associated cytokines(IL-17A and IL-17F)in severe asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2009，123(5):1185-1187.

［3］ Weaver CT，Hatton RD.Interplay between the TH17 and TRegcell lineages:a(co-)evolutionary perspective［J］.Nat Rev Immunol，2009，9(12):883-889.

［4］ 甄國華，劉紅梅，張珍祥，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)木瓜蛋白酶和［60Co］照射所致大鼠肺氣腫的作用［J］. 中國病理生理雜志，2008，24(8):1529-1533.

［5］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南［J］.中華兒科雜志，2008，46(10):745-753.

［6］ 黃雪瓊，檀衛(wèi)平，麥賢弟，等.哮喘患兒外周血RORC和Foxp3 mRNA表達(dá)水平的變化及其意義［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2012，33(2):190-194.

［7］ 黃雪瓊，檀衛(wèi)平，王東燁，等.哮喘患兒外周血 RORC mRNA、IL-17水平及其與氣道重塑的關(guān)系研究［J］.新醫(yī)學(xué)，2014，45(2):104-107.

［8］ Beyth S，Borovsky Z，Mevorach D，et al.Human mesenchymal stem cells alter antigen-presenting cell maturation and induce T-cell unresponsiveness［J］.Blood，2005，105(5):2214-2219.

［9］ Augello A，Tasso R，Negrini SM，et al.Cell therapy using allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells prevents tissue damage in collagen-induced arthritis［J］.Arthritis Rheum，2007，56(4):1175-1186.

［10］Zappia E，Casazza S，Pedemonte E，et al.Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy［J］.Blood，2005，106(5):1755-1761.

［11］ Djouad F，Plence P，Bony C，et al.Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals［J］.Blood，2003，102(10):3837-3844.

［12］ Ghannam S，Pene J，Torcy-Moquet G，et al.Mesenchymal stem cells inhibit human Th17 cell differentiation and function and induce a T regulatory cell phenotype［J］.J Immunol，2010，185(1):302-312.

［13］ Kapoor S，Patel SA，Kartan S，et al.Tolerance-like mediated suppression by mesenchymal stem cells in patients with dust mite allergy-induced asthma［J］.J Allergy Clin Immunol，2012，129(4):1094-1101.