徐水凌， 朱 佳， 張新紅， 邵平揚， 鄭文文

創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus，Vv)屬一種分布于海洋魚類及貝母類、嗜鹽性革蘭陰性桿菌，主要經(jīng)接觸疫水或攝入被其污染的海產(chǎn)品，引起傷口感染、胃腸炎或原發(fā)性敗血癥，具有起病急、病情進展快、致死率高等特征［1-4］，是沿海地區(qū)一種致死率高的重要傳染?。?］。創(chuàng)傷弧菌進入機體后，與宿主免疫細胞之間的相互作用，是了解和認識這種細菌致病機制的重要方面，也為臨床尋找創(chuàng)傷弧菌感染的治療靶點提供重要的理論基礎(chǔ)，創(chuàng)傷弧菌的致病機制值得深入研究。樹突狀細胞(dentritic cell，DC)作為重要的抗原提呈細胞(antigen-presenting cell，APC)，在創(chuàng)傷弧菌感染的保護性免疫中起著始動者作用［6］。線粒體被認為是控制細胞凋亡或壞死的樞紐，可通過釋放凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)和細胞色素 C(cytochrome C，Cyt C)使細胞發(fā)生凋亡［7］。創(chuàng)傷弧菌感染樹突狀細胞后的線粒體損傷可能與細胞凋亡相關(guān)。因此，了解線粒體損傷在創(chuàng)傷弧菌誘導(dǎo)樹突狀細胞凋亡過程中的作用及其可能機制，NF-κB p65和TNF-α信號分子是否表達以及與細胞凋亡的關(guān)系，對深入闡明創(chuàng)傷弧菌的致病機制具有重要意義。

材料和方法

1 材料

創(chuàng)傷弧菌(Vv 1.1758株)購于中國科學(xué)院微生物研究所;小鼠樹突狀細胞(DC2.4)細胞株由浙江大學(xué)免疫研究所惠贈，本實驗室常規(guī)培養(yǎng)并保存。RPMI-1640細胞培養(yǎng)液購自Gibco;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青生物制品有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均購自Ameresco;Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;鈣離子熒光探針Fluo-8/AM購自Abcam;NF-κB p65和 TNF-α鼠單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology;羊抗鼠IgG-HRP購自Thermo;ECL免疫印跡底物購自Bio-Rad。

2 方法

2.1 Vv 1.1758 與 DC2.4 細胞混合培養(yǎng)模型建立Vv 1.1758經(jīng)37℃、哥倫亞血瓊脂培養(yǎng)基孵育24 h，挑取生長良好的菌落，無菌 PBS(pH 7.4，0.01 mol/L)洗3次后，重懸于不含抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，調(diào)整其細菌濃度為2.0×1010CFU/L，備用。取6孔細胞培養(yǎng)板，接種DC2.4細胞(5.2×108/L)各 2 mL，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入2 mL 10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液(無抗生素)，分別孵育2 h。小心吸棄培養(yǎng)液，按細菌∶細胞(MOI)約為40∶1的比例，每孔加入Vv 1.1758懸液1 mL(濃度為2.0×1010CFU/L)，Vv 1.1758與 DC2.4細胞在37 ℃分別共培育0、1、2、3、4、5 和6 h 時回收細胞。

2.2 掃描電鏡觀察Vv 1.1758侵入的DC2.4細胞收集0、2、4和6 h時段與 Vv 1.1758共育的 DC2.4細胞，棄培養(yǎng)液，加PBS吹打，2 500 r/min離心10 min，重復(fù)2次，以2%戊二醛磷酸緩沖液4℃固定2 h，PBS 洗3 次，每次30 min，1%鋨酸固定1.5 h，PBS洗3次，每次30 min;梯度乙醇、丙酮逐級脫水;經(jīng)置換、常規(guī)臨界點干燥、粘臺、噴金后，掃描電鏡下觀察Vv 1.1758侵入DC2.4細胞的形態(tài)學(xué)變化。

2.3 透射電鏡觀察DC2.4細胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)收集Vv 1.1758共培育的 DC2.4細胞，4%(V/V)戊二醛4℃固定2 h，PBS洗3次，鋨酸再固定，丙酮脫水，樹脂包埋，超薄切片后鉛鈾染色，透射電鏡下觀察DC2.4細胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)。

中國的茶葉在國際茶葉銷售市場上的認可度普遍偏低，西方發(fā)達國家對我國出口的茶葉標準尤為嚴苛。江西出口茶葉缺乏自有知名品牌，這不僅影響出口貿(mào)易的收益，也不利于出口茶葉的國際競爭力的提高，更不利于對外貿(mào)易的持續(xù)發(fā)展。

2.5 細胞內(nèi)Ca2+離子水平檢測 采用Ca2+熒光探針Fluo-8/AM單染色法標記，收集上述共培育時段的5.2×108/L DC2.4細胞，以D-Hanks液洗滌3次，加入5 μmol/L Fluo-8/AM染液，37℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min負載探針，Hanks洗滌3次。熒光顯微鏡及熒光成像系統(tǒng)掃描記錄不同處理時點細胞內(nèi)熒光強度，細胞熒光復(fù)合物的熒光強度經(jīng)計算機軟件(Zeiss)計算。

2.4 細胞內(nèi)ROS水平的檢測 采用DCFH-DA染色法檢測 DC2.4 細胞內(nèi) ROS。收集 0、1、2、3、4、5 和6 h時段與 Vv 1.1758 共培育的 5.2 ×108/L DC2.4細胞爬片，每個載玻片中加入含10 μmol/L DCFHDA的無抗生素、無血清的RPMI 1640各600 μL，37℃避光孵育30 min，PBS洗滌載玻片3次，自然干燥，50%丙三醇/PBS封片，熒光顯微鏡及熒光成像系統(tǒng)掃描記錄不同共育時點細胞內(nèi)熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長527 nm)，熒光圖像經(jīng)計算機軟件(Zeiss)計算細胞內(nèi)熒光物的熒光強度。

2.6 細胞線粒體膜電位檢測 收集0、2、4和6 h時段Vv 1.1758共培育的DC2.4細胞(各時段均設(shè)4個復(fù)孔)，加入JC-1染色工作液(5 mg/L)，37℃孵育20 min，以JC-1染色緩沖液洗滌2次，2 000 r/min、4℃離心5 min，收集細胞，PBS離心、洗滌2次后，以FL-1為綠色熒光檢測通道，F(xiàn)L-2為紅色熒光檢測通道，流式細胞術(shù)檢測綠色熒光率以反映線粒體膜電位的變化。

侵入前，DC2.4細胞線粒體飽滿呈橢圓形粒狀，線粒體嵴分布清晰 (圖2A)。侵入時，Vv 1.1758與DC2.4細胞共育2 h，DC2.4細胞線粒體呈輕微球形腫脹，線粒體嵴出現(xiàn)斷裂，基質(zhì)變淡(圖2B);4 h時，線粒體呈高度球形腫脹，線粒體嵴模糊不清(圖2C);6 h時，線粒體膜破碎，嵴完全消失，大量空泡形成，細胞器結(jié)構(gòu)紊亂(圖2D)。

與 Vv 1.1758 和 DC 2.4 細胞共培育 0 h(65.6±7.8)比較，NF-κB p65 蛋白在共培育 1 h(98.8 ±10.2)、2 h(96.3 ± 9.1)、3 h(124.5 ± 13.5)、4 h(168.5 ±18.9)、5 h(198.5 ±19.6)和6 h(192.0 ±18.6)的表達量均上升(P ＜0.05);而 TNF-α 蛋白與共培育0 h(31.6 ±6.2)比較，2 h(58.3 ±8.2)、3 h(59.4 ±8.9)、4 h(63.4 ±8.7)、5 h(64.2 ±8.5)和6 h(92.6±9.6)的表達量上升(P ＜0.05)，見圖 7。NF-κB p65蛋白表達在共培育1 h即開始升高，TNF-α蛋白則在共培育2 h開始增高。

侵入前，DC2.4細胞核呈圓形或橢圓形，細胞表面光滑，細胞間隔清晰(圖1A);侵入時，Vv 1.1758與DC2.4細胞混合培養(yǎng)2 h，可見有少量Vv 1.1758菌體一端黏附于細胞表面(圖1B);4 h時，DC2.4細胞呈現(xiàn)輕微腫脹，細胞有較多的Vv 1.1758黏附，Vv 1.1758以菌體一端與細胞表面結(jié)合方式侵入細胞(圖1C);6 h時，DC2.4細胞呈現(xiàn)高度腫脹，細胞表面出現(xiàn)點狀的球狀突起，Vv 1.1758菌體整體黏附于細胞表面并侵入細胞(圖1D)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。各樣本先進行方差齊性檢驗，再采用單因素方差分析法對資料進行處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

Vv 1.1758 與 DC2.4 細胞共育3、4、5 和6 h時，胞內(nèi) Ca2+熒光強度分別為 40.2 ±4.8、58.2 ±6.8、60.6±5.8 和 68.6 ±5.2，與對照組(18.4 ±2.2)比較，差異顯著(P ＜0.05)，見圖4。這提示 Vv 1.1758侵入DC2.4細胞后可導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+升高。

結(jié) 果

1 掃描電鏡觀察DC2.4細胞的形態(tài)學(xué)變化

中南佛州水利工程的設(shè)計與施工完全由聯(lián)邦政府主導(dǎo)，到20世紀70年代基本竣工。從本質(zhì)上講，該項目有很大的應(yīng)急成分，因此，在應(yīng)用、管理過程中一些過去沒有考慮到的問題逐漸顯現(xiàn)。

Figure 1.Vv 1.1758 invading the DC2.4 cells observed under scanning electronic microscope(×8 500，scale bar=1 μm).A:the control DC2.4 cells before invasion;B ～ D:the situations of Vv 1.1758 invading DC2.4 cells at 2，4 and 6 h，respectively.圖1 Vv 1.1758侵入DC2.4細胞的掃描電鏡照片

2 透射電鏡觀察DC2.4細胞線粒體的超微結(jié)構(gòu)

2.7 細胞凋亡率檢測 按上述方法收集Vv 1.1758共培育的 DC2.4 細胞，以 PBS(pH 7.4，0.01 mol/L)洗滌3次，然后分別用Annexin V-FITC和propidium iodide(PI)染色，按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒操作說明書，流式細胞術(shù)檢測各時段的細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。

Figure 2.Vv 1.1758 invading the DC2.4 cells observed under ttransmission electronic microscope(×16 000，scale bar=1 μm).A:the control DC2.4 cells before invasion;B ～ D:represented the situations of Vv 1.1758 invading DC2.4 cells at 2，4 and 6 h，respectively.圖2 Vv 1.1758侵入DC2.4細胞的透射電鏡照片

3 DC2.4細胞內(nèi)的ROS水平

Vv 1.1758 與 DC2.4 細胞共培育2、3、4、5 和6 h時，DC2.4 細胞內(nèi)的熒光強度分別為 28.9 ±5.6、31.2 ±7.8、37.2 ±6.9、49.6 ±8.9 和 38.6 ±7.2，顯著高于對照組(9.8 ±1.2;P ＜0.05)，見圖 3。這提示ROS在DC2.4細胞線粒體損傷和細胞凋亡中可能發(fā)揮重要的作用。

Figure 3.The changes of ROS fluorescence intensity in the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time(×200，scale bar=10 μm).Mean ± SD.n=4.*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control.圖3 DC2.4細胞與Vv 1.1758共培育不同時間細胞內(nèi)ROS熒光強度的變化

4 DC2.4細胞胞內(nèi)Ca2+的變化

飛速發(fā)展的信息技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于課程教學(xué)中，與英語課程的融合日益加強。信息化教學(xué)對英語教師提出了更高的要求，教師不僅要及時更新和拓展自己的信息知識結(jié)構(gòu)，更要具備靈活運用信息技術(shù)的能力。當前，各高校大部分英語教師的信息素養(yǎng)不高，信息技術(shù)知識比較匱乏，主要局限于簡單的PPT課件制作，對較復(fù)雜的教學(xué)編輯軟件操作不熟悉。英語教師信息技術(shù)應(yīng)用能力不高，一方面緣于教師自身沒有及時更新知識所致，另一方面各高校組織英語教師進行有關(guān)信息技術(shù)應(yīng)用的培訓(xùn)較少，這成為制約當前高校英語數(shù)字化教學(xué)資源共建共享的瓶頸。

5 DC2.4細胞線粒體膜電位的變化

Vv 1.1758與 DC2.4細胞共培育2、4和6 h后，流式細胞術(shù)檢測細胞綠色熒光率分別為(18.9±3.5)%，(49.9 ±8.7)%和(62.5 ±11.5)%，顯著高于對照組［(6.9 ±0.6)%;P ＜0.05］，線粒體膜電位分別下降 12.0%、43.0%和 46.6%，見圖 5。

6 Vv 1.1758 誘導(dǎo) DC2.4 細胞凋亡

Vv 1.1758 與 DC2.4 細胞混合培養(yǎng)2、4 和6 h，細胞凋亡率分別為(27.8 ±8.6)%、(36.3 ±11.7)%和(56.8±15.6)%，顯著高于正常 DC2.4細胞對照組［(3.2 ±0.8)%;P ＜0.05］，并呈一定的時間依賴性，見圖6。

Figure 4.Intracellular Ca2+fluorescence intensity in the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time.Mean ± SD.n=4.*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control.圖4 DC2.4細胞與Vv 1.1758共培育不同時間細胞內(nèi)Ca2+的變化

Figure 5.The changes of mitochondrial transmembrane potential of the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time.A:the control DC2.4 cells before invasion;B ～ D:the situations of Vv 1.1758 invading DC2.4 cells at 2 h，4 h and 6 h，respectively.圖5 DC2.4細胞與Vv 1.1758共培育不同時間線粒體膜電位的變化

Figure 6.Apoptotic rates of the DC2.4 cells induced by Vv 1.1758.A:the normal DC2.4 cells;B ～ D:the apoptotic rates of DC2.4 cells co-culture with Vv 1.1758 for 2 h，4 h，6 h，respectively.圖6 Vv 1.1758誘導(dǎo)DC2.4細胞凋亡率變化

7 NF-κB p65 和 TNF-α蛋白的表達

2.8 Western blotting檢測 收集 0、1、2、3、4、5 和 6 h共育時段的 DC2.4細胞，加入250 μL含 PMSF的RIPA細胞裂解液，超聲破碎細胞(300 V，1 s×5)，15 000 r/min(離心半徑7.5cm)離心10 min，BCA 法測定上清液蛋白濃度，加等體積的2×電泳加樣緩沖液，95℃水浴5 min，上樣，電泳(濃縮膠20 mA，分離膠35 mA)，電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(120 mA，120 min)，10%脫脂奶粉室溫封閉4 h，TBST漂洗3次，分別加入1∶200稀釋的 NF-κB p65和 TNF-α 鼠單克隆抗體，4℃孵育過夜，1∶2 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRPⅡ抗孵育2 h，TBST洗膜3次后ECL顯色，ChemiDocTMMP系統(tǒng)記錄不同時段 NF-κB p65和TNF-α的表達。以Quality One軟件計算蛋白產(chǎn)物條帶的相對吸光度值。

Figure 7.Western blotting analysis of NF-κB p65 and TNF-α expression in the DC2.4 cells co-cultured with Vv 1.1758 for different time.圖7 DC2.4細胞與Vv 1.1758共培育不同時間NF-κB p65和TNF-α蛋白表達的變化

討 論

DCs是人體內(nèi)重要的免疫細胞，其作為體內(nèi)重要的抗原遞呈細胞，在抗病原菌早期感染及其抗原的加工和提呈中起著重要的作用［8-9］。在創(chuàng)傷弧菌與免疫細胞間相互作用的研究中發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌可將淋巴細胞作為靶細胞誘導(dǎo)淋巴細胞發(fā)生凋亡［10］，巨噬細胞也可發(fā)生類似的細胞凋亡作用［11］。創(chuàng)傷弧菌能否誘導(dǎo)DC凋亡，從而實現(xiàn)免疫逃逸，達到在體內(nèi)生存并繁殖的目的，對深入了解創(chuàng)傷弧菌感染的致病機制，為臨床治療選擇合理的治療靶位具有重要意義。

3.施工企業(yè)綜合競爭力不斷增強。通過清理項目管理程序、規(guī)范管理制度、優(yōu)化項目管理組織，促進了先進的管理方式、先進管理理念的運用。強化了項目前期風險防控，優(yōu)化施工組織，引進了先進工藝，企業(yè)產(chǎn)能工程達產(chǎn)率逐步提升，經(jīng)濟效益得到提高，施工隊伍素質(zhì)和管理水平得到提高，企業(yè)的客戶滿意率不斷上升，外部市場開拓空間不斷加大，企業(yè)核心競爭力穩(wěn)步增強。

線粒體不僅是細胞的能量工廠，而且也是細胞凋亡的調(diào)控中心，主要經(jīng)Cyt C-caspase-9依賴途徑和非caspase依賴途徑調(diào)控細胞凋亡，眾多致病因素如:病原菌感染、炎癥反應(yīng)、缺血-再灌注等均可通過線粒體的損傷而誘導(dǎo)細胞凋亡［12-13］。我們先前已發(fā)現(xiàn)，Vv感染DC可通過TLR2、4受體表達上調(diào)，TNF-α炎癥介質(zhì)增加導(dǎo)致DNA降解，誘導(dǎo)DC細胞凋亡和壞死［14］。本實驗經(jīng)掃描和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Vv 1.1758與DC2.4細胞混合培養(yǎng)2 h，即可有少量Vv 1.1758菌體一端黏附于細胞表面，線粒體呈輕微球形腫脹，線粒體嵴出現(xiàn)斷裂，基質(zhì)變淡;共育4 h時，DC2.4細胞表面則有較多的Vv 1.1758黏附，以菌體一端與細胞表面結(jié)合方式侵入細胞，細胞線粒體呈高度球形腫脹，線粒體嵴模糊不清;6 h時，菌體整體黏附于細胞表面并侵入細胞，DC2.4細胞呈現(xiàn)高度腫脹并出現(xiàn)點狀的球狀突起，線粒體膜破碎，嵴完全消失，胞內(nèi)有大量空泡形成。提示:Vv 1.1758侵入DC2.4細胞的早期，即可引起DC線粒體損傷。此外，線粒體呼吸鏈是細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要場所，胞內(nèi)ROS的升高可引起線粒體的損傷，DCFH-DA是目前最為常用和靈敏的胞內(nèi)ROS檢測的熒光探針，DCF的熒光強度可反映胞內(nèi)ROS水平［15］。本實驗結(jié)果顯示，Vv 1.1758與 DC2.4細胞共育2 h時，ROS即開始升高，至5 h達高峰。我們推測:Vv 1.1758引起的DC2.4細胞線粒體損傷，與胞內(nèi)ROS的升高密切相關(guān)。

田林平塘高山漢族諺語研究——百色市高山漢族語言文化系列研究之一 ………………………………………… 黃 革（6/64）

電網(wǎng)調(diào)度系統(tǒng)容易受到一些不可抗因素的影響，例如自然災(zāi)害等。一旦遇到大的自然災(zāi)害，電網(wǎng)將會有可能中斷。這時，必須建立起應(yīng)急響應(yīng)機制，使得電網(wǎng)調(diào)度能夠在自然災(zāi)害發(fā)生后電網(wǎng)出現(xiàn)故障的情況下，應(yīng)急機制能夠及時發(fā)揮作用。當前的許多地方，由于對自然災(zāi)害等不可抗因素的認識不夠充分，重視程度不夠，或者沒有建立應(yīng)急響應(yīng)機制或者是應(yīng)付差事的應(yīng)急響應(yīng)機制，這就嚴重影響了電網(wǎng)的安全運行。

線粒體除合成機體所需的ATP外，也具有攝取、釋放、調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度的作用。大量研究證實，細胞內(nèi)鈣失衡是啟動細胞凋亡的關(guān)鍵因素［16］。胞內(nèi)Ca2+增多，可引起線粒體膜電位降低，從而使線粒體內(nèi)貯鈣進一步釋放，引起細胞內(nèi)鈣持續(xù)增加以及DNA斷裂，由此形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細胞凋亡或死亡;此外，ROS也可加劇 Ca2+的超載［17］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，Vv 1.1758與DC2.4細胞共育3 h時，細胞內(nèi)Ca2+迅速升高，并隨共育時間的延長，細胞內(nèi)Ca2+升高更趨明顯，呈一定的時間依賴性;共育2 h、4 h和6 h時，線粒體膜電位值分別下降12.0%、43.0%和46.6%;細胞凋亡率則分別為(27.8±8.6)%，(36.3 ±11.7)%和(56.8 ±15.6)%，明顯高于正常DC2.4細胞對照組(3.2±0.8)%(P＜0.05)。我們認為創(chuàng)傷弧菌在侵入DC2.4細胞時，同樣存在著細胞內(nèi)鈣的失衡，胞內(nèi)Ca2+濃度的顯著升高和線粒體膜電位下降，是誘導(dǎo)DC2.4細胞發(fā)生凋亡的另一重要環(huán)節(jié)。

NF-κB是眾多細胞因子和炎癥介質(zhì)表達的轉(zhuǎn)錄因子之一，主要由兩種Rel家庭蛋白構(gòu)成的同源或異源二聚體蛋白質(zhì)，p65是Rel家庭成員之一，其表達與免疫和炎癥反應(yīng)高度相關(guān)，NF-κB p65的活化可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量TNF-α、IL等促炎因子，參與細胞凋亡等多種生物過程［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB p65 蛋白在Vv 1.1758與DC2.4細胞共育1 h，即開始升高，至5 h達高峰，共育6 h稍有下降;TNF-α蛋白則在共育2 h開始增高，至6 h達高峰。這提示:NF-κB p65和TNF-α有可能是創(chuàng)傷弧菌誘導(dǎo)樹突狀細胞凋亡過程中的重要信號分子。

我們的實驗結(jié)果表明，線粒體損傷在Vv 1.1758誘導(dǎo)DC2.4細胞凋亡中起著重作用，其機制可能與胞內(nèi)ROS的升高、Ca2+濃度的顯著升高和線粒體膜電位下降有關(guān)，NF-κB p65和TNF-α有可能是細胞凋亡過程中的重要信號分子。然而，在線粒體損傷時，非caspase依賴的AIF、核酸內(nèi)切酶G等是否釋放表達，尚有待進一步研究證實。

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