虞曉明， 郭 瑞， 唐江鋒， 黃曉穎， 王良興

近年來(lái)基因敲除和基因?qū)胄∈竽Ｐ鸵褟V泛應(yīng) 用于肺循環(huán)疾病的在體研究［1］。而體外模型仍以大鼠為主要研究對(duì)象，基因敲除小鼠由于技術(shù)問(wèn)題難以進(jìn)入體外研究領(lǐng)域，特別是小鼠肺細(xì)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arteriolar smooth muscle cells，PASMCs)的傳代培養(yǎng)，國(guó)內(nèi)外鮮少報(bào)道。國(guó)內(nèi)外肺循環(huán)離體培養(yǎng)目前大多采用大鼠為研究對(duì)象，難以與在體研究的基因敲除小鼠模型研究相匹配。體循環(huán)雖可見少數(shù)主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)的體外研究［2］，但與主動(dòng)脈相比，肺細(xì)小動(dòng)脈更難分離，平滑肌細(xì)胞更加脆弱，技術(shù)上更加困難。國(guó)外關(guān)于小鼠PASMCs培養(yǎng)僅限于原代培養(yǎng)，且所用的試劑復(fù)雜［3］，目前尚未見PASMCs傳代的研究報(bào)告。因此，如何便捷、高效地培養(yǎng)小鼠原代PASMCs及傳代，對(duì)傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)提出了一個(gè)新的挑戰(zhàn)。本研究室不斷探索與研究，發(fā)現(xiàn)采用酶消化結(jié)合血清鋪底法培養(yǎng)小鼠原代PASMCs方法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，改良傳代法可以更好地保持細(xì)胞的活性，并經(jīng)初步探索發(fā)現(xiàn)低氧促進(jìn)小鼠PASMCs的增殖，抑制其凋亡，為肺循環(huán)疾?。?］的研究提供可靠的體外模型。

材料和方法

1 主要材料

健康雄性BALB/c小鼠(23±2)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青-鏈霉素(雙抗)、0.25% 胰酶/EDTA和0.25%胰酶(不含EDTA)均為Gibco產(chǎn)品;磷酸鹽緩沖液(PBS)和蘇木素購(gòu)自Solarbio;小鼠源性 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體購(gòu)自Abcam;DyLightTM488結(jié)合的山羊抗小鼠IgG、Triton X-100購(gòu)自上海博蘊(yùn)生物科技公司;膠原酶I和4′，6-二脒基-2-苯吲哚鹽酸(DAPI)購(gòu)自Sigma;鼠二步法檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋;Cell Counting Kit-8(CCK-8)購(gòu)自日本同仁研究所;In Site Cell Death Detection Kit和POD檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche。

2P ASMCs的培養(yǎng)

2.1 膠原酶I消化結(jié)合血清鋪底法培養(yǎng)原代

PASMCs(1)麻醉小鼠:健康雄性BALB/c小鼠，用10%水合氯醛0.1 mL經(jīng)腹腔注射麻醉，放入預(yù)先配好的75%乙醇中浸泡3～5 min。(2)取心肺組織:頸椎脫臼法處死小鼠后在超凈平臺(tái)內(nèi)，迅速剖開胸腔取心肺組織，放入盛有無(wú)菌PBS液體的培養(yǎng)皿中，清洗2～3次。(3)分離肺細(xì)小動(dòng)脈:在超凈平臺(tái)內(nèi)，體視顯微鏡直視下分離肺細(xì)小動(dòng)脈。把肺動(dòng)脈外纖維膜剝離干凈，保留2～4級(jí)的肺細(xì)小動(dòng)脈用于原代培養(yǎng)，將分離的動(dòng)脈放于含雙抗的PBS中漂洗數(shù)次。小鼠肺動(dòng)脈細(xì)而薄，內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量少，為避免損傷平滑肌細(xì)胞，勿需去除內(nèi)皮細(xì)胞。(4)消化:將肺動(dòng)脈剪成約1 mm×1 mm大小，放入盛有0.2%膠原酶I的離心管中，輕柔搖動(dòng)數(shù)次。置于CO2培養(yǎng)箱中，消化50～80 min。(5)細(xì)胞貼壁:待動(dòng)脈碎塊消化成絮狀物，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入1 mL含10%FBS的DMEM，吹打均勻后，轉(zhuǎn)移至預(yù)先500 μL FBS鋪底的25 cm2培養(yǎng)瓶后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。(6)24～48 h后，觀察細(xì)胞貼壁情況，補(bǔ)充1 mL含10%FBS的DMEM，3～5 d可見細(xì)胞呈梭形。1周前后細(xì)胞融合生長(zhǎng)，約長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶80%，即可傳代培養(yǎng)。

2.2 PASMCs的傳代培養(yǎng) 細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)培養(yǎng)瓶80% ～90%時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS清洗培養(yǎng)瓶2～3次，加入適量0.25%胰酶/EDTA，均勻搖晃2～3次培養(yǎng)瓶后迅速吸去胰蛋白酶，留約12 μl/cm2的胰蛋白酶量，再補(bǔ) 8 μl/cm20.25% 胰酶(不含 EDTA)，置于CO2培養(yǎng)箱中消化約1～3 min，鏡下觀察胞質(zhì)回縮，細(xì)胞大量浮于液體中時(shí)加入適量含10%FBS的DMEM終止消化，反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液，棄去傳統(tǒng)的離心步驟。按1∶2將細(xì)胞懸液均勻分置于培養(yǎng)瓶中，加適量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。5～7 d即可傳代，3～5 d換液，依據(jù)細(xì)胞活性可傳3～5代。

3P ASMCs的純化

3.1 人工純化 在分離肺動(dòng)脈的過(guò)程中，盡量剝離干凈肺動(dòng)脈外纖維膜是關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用體視顯微鏡(Nikon SMZ 745T)，高效剝除肺動(dòng)脈外膜，為小鼠PASMCs的培養(yǎng)傳代提供了明顯的優(yōu)勢(shì)。在培養(yǎng)過(guò)程中仍混有的細(xì)胞可用以下方法除去。(1)機(jī)械刮除法:即采用機(jī)械方法去除不需要的細(xì)胞區(qū)域，而保留PASMCs區(qū)域:顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)(成纖維細(xì)胞多呈瘦長(zhǎng)狀，有觸角)，用記號(hào)筆標(biāo)記成纖維細(xì)胞區(qū)域后，用彎頭滴管反復(fù)推刮標(biāo)記區(qū)域，不要傷及PASMCs區(qū)域，推刮后用PBS沖洗，加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。反復(fù)多次可以純化細(xì)胞，操作過(guò)程中嚴(yán)格無(wú)菌，防止污染。(2)酶消化法:成纖維細(xì)胞和PASMCs對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同，在消化培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，常是成纖維細(xì)胞先于PASMCs脫壁，特別是在原代和培養(yǎng)早期的細(xì)胞這種差別尤為明顯，因而可以利用這種差別來(lái)純化。在小鼠PASMCs的傳代過(guò)程中，實(shí)際上也利用了酶消化法來(lái)純化。(3)反復(fù)貼壁法:小鼠成纖維細(xì)胞與PASMCs相比，其貼壁過(guò)程快，貼壁時(shí)間大約10～15 min，而PASMCs貼壁時(shí)間一般在1～4 h以上，可以利用這個(gè)特點(diǎn)來(lái)純化細(xì)胞:0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后，加入含10%血清培養(yǎng)基吹打制成細(xì)胞懸液后接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放入培養(yǎng)箱內(nèi)靜置約10 min，鏡下觀察有部分成纖維細(xì)胞貼壁，將未貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)到第2個(gè)培養(yǎng)瓶中，再次靜置約10 min，未貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)到第3個(gè)培養(yǎng)瓶中，第3瓶中即為較純的PASMCs。

3.2 自然純化法 平滑肌細(xì)胞的組織量較上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的組織量多，利用PASMCs的增殖優(yōu)勢(shì)抑制前兩者細(xì)胞的生長(zhǎng)，最后留下增殖較旺盛的平滑肌細(xì)胞。平滑肌細(xì)胞的純度會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸增高。

4P ASMCs的鑒定

4.1 細(xì)胞形態(tài)鑒定 鏡下觀察原代培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，并攝片保存。

4.2 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 (1)將PASMCs接種于含有蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)1～2 d。(2)棄培養(yǎng)液，加入PBS，漂洗細(xì)胞爬片，5 min×3次。(3)4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗5 min×3次。(4)用0.1%Triton X-100(PBS配制)室溫下滲透細(xì)胞10 min，PBS漂洗5 min×3次。(5)加入小鼠源性 α-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(稀釋比1∶200，PBS稀釋)，4℃過(guò)夜。(6)在PBS液中漂洗5 min×3次，加入鼠二步法試劑，并于37℃水浴箱中孵育30 min。(7)PBS漂洗5 min×3次。(8)DAB溶液顯色，蘇木素復(fù)染，清水漂洗。(9)在濃度為75%→85%→95%→100%梯度乙醇脫水，最后中性樹膠封片保存。

4.3 免疫熒光染色法鑒定 (1)細(xì)胞爬片后固定及通透過(guò)程如免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定中的1～4步驟。(2)3%山羊血清(PBS配制)封閉非特異性抗原30 min。(3)小鼠源性 α-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(稀釋比1∶100，PBS稀釋)，4 ℃過(guò)夜。(4)PBS漂洗5 min×3次后，滴加 DylightTM488山羊抗小鼠 IgG(稀釋比1∶200，PBS稀釋)室溫避光孵育細(xì)胞1 h，PBS漂洗5 min×3次。(5)滴加細(xì)胞核染色液DAPI(1 mg/L)室溫避光孵育3～5 min，PBS漂洗5 min×3次。(6)免疫熒光顯微鏡下對(duì)同一視野以不同激發(fā)波長(zhǎng)(Dylight488:488 nm和DAPI:358 nm)觀察并攝片。

4.4 細(xì)胞常氧與低氧實(shí)驗(yàn)分組 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后分組接種。一般細(xì)胞長(zhǎng)滿80%左右時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h同步化，然后分別常氧條件(37 ℃、21%O2、5%CO2、74%N2)和低氧條件(37 ℃、5%O2、5%CO2、90%N2)下培養(yǎng)24 h。

4.5 CCK-8染色法檢測(cè)細(xì)胞的活性 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，密度約為 8 ×107cells/L，100 μL/well，用含10%FBS的 DMEM 補(bǔ)到200 μL，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)約24 h。每組均6孔，每孔溶液總體積均為200 μL，并設(shè)置不含細(xì)胞的空白對(duì)照組。顯微鏡下見細(xì)胞長(zhǎng)滿80%左右時(shí)換無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓同化24 h，分別于常氧和低氧下培養(yǎng)24 h。干預(yù)結(jié)束后，棄上清，各孔加入無(wú)血清DMEM 100 μL+CCK-8試劑10 μL，避光繼續(xù)培養(yǎng)2 ～4 h。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度(absorbance，A值)。

4.6 TUNEL法測(cè)定細(xì)胞的凋亡 分組干預(yù)結(jié)束后，細(xì)胞爬片用PBS液短暫漂洗2次(1 min×2次)，4%多聚甲醛(PBS配制，pH 7.4)在15～25℃下固定1 h;PBS漂洗5 min×3次后，3%H2O2(甲醇配制)，15～25℃下孵育10 min后，PBS漂洗5 min×3次。0.1%Triton X-100(0.1%檸檬酸鈉配制)，2～8℃促滲2 min，PBS漂洗5 min×3次，吸干樣品周圍的水分，每張玻片滴加現(xiàn)配TUNEL reaction mixture(體積比 enzyme solution:label solution=1∶9)50 μL，置濕盒中，于37℃恒溫水浴箱孵育60 min后，PBS漂洗5 min×3次;滴加50 μL Convert-POD，置37 ℃恒溫水浴箱孵育30 min后，PBS漂洗5 min×3次;室溫下滴加DAB顯色試劑混合液，顯色約5 min，顯微鏡下觀察，適時(shí)終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，清水漂洗，封片同免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。按下法制備陽(yáng)性對(duì)照樣品:將經(jīng)固定和通透處理的細(xì)胞與重組的DNase I反應(yīng)10 min。陰性對(duì)照樣品的制備:將經(jīng)固定和通透處理的細(xì)胞與50 μL/well的標(biāo)記溶液一起孵育，余步驟同上。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，方差齊性采用Levene檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 細(xì)胞生長(zhǎng)情況

倒置相差顯微鏡下，剛種植的細(xì)胞呈圓形、透亮、單個(gè)或呈細(xì)胞團(tuán)分布，組織塊則變得疏松，細(xì)胞間隙變大;1～2 d后見大部分單細(xì)胞貼壁，呈圓形，少量未貼壁細(xì)胞上浮;3～5 d可見貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增多，多呈梭形，或呈三角形等形狀，見圖1。5～7 d細(xì)胞可鋪滿80% ～90%的25 cm2的培養(yǎng)瓶。傳代后的細(xì)胞形態(tài)上與原代相比差異較大，見圖2，細(xì)胞多鋪展開來(lái)，形態(tài)各異，經(jīng)鑒定確定為PASMCs。

Figure 1.Primary culture of pulmonary arteriolar smooth muscle cells.A:explant method after digestion(×100);B:digestion method(×100);C:digestion method(×200).圖1 原代肺細(xì)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

Figure 2.Passages of cultured pulmonary arteriolar smooth muscle cells(×100).A:the 2nd generation;B:the 3rd generation.圖2 傳代肺細(xì)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

2 鑒定結(jié)果

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示約95%細(xì)胞都能表達(dá)α-SMA，細(xì)胞胞漿呈棕黃色，胞質(zhì)中有細(xì)絲狀物質(zhì)，為肌動(dòng)蛋白，見圖3;免疫熒光結(jié)果也同樣顯示約95%細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞，見圖4。

Figure 3.Immunocytochemistry staining with α-smooth muscle actin antibody showed brown parallel myofilament(A:×50;B:×400).圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果

Figure 4.Immunofluorescence staining with α-smooth muscle actin antibody showed myofilament(A:×100;B:×200).圖4 免疫熒光染色法結(jié)果

3 CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖結(jié)果

CCK-8 A值與細(xì)胞數(shù)量成正比，其值大小可作為細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的比較。如表1所示，低氧組A值高于常氧對(duì)照組(P＜0.05)，提示低氧組小鼠PASMCs增殖明顯。

4 TUNEL法測(cè)定細(xì)胞的凋亡結(jié)果

細(xì)胞核染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，隨機(jī)取6個(gè)高倍視野(×400)計(jì)算凋亡指數(shù)(apoptotic Index，AI)，AI=(視野內(nèi)凋亡 PASMCs數(shù)/視野內(nèi)所有PASMCs數(shù))×100%。如圖5、表1所示，低氧組AI值低于常氧對(duì)照組(P＜0.05)，提示低氧組小鼠PASMCs凋亡減少。

Figure 5.Effects of normoxia and hypoxia interventions on apoptosis of mouse PASMCs(TUNEL method).A:control group(×100);B:hypoxia(24 h)group(×100);C:positive control(×400);D:negative control(×400).Arrows show the apoptotic nuclei.圖5 TUNEL檢測(cè)常氧和低氧干預(yù)對(duì)小鼠PASMCs凋亡的影響

表1 常氧和低氧干預(yù)對(duì)小鼠PASMCs CCK-8 A值和凋亡指數(shù)的影響Table 1.Effects of normoxia and hypoxia interventions on CCK-8 A value and apoptotic index of mouse PASMCs(Mean±SD.n=6)

討 論

基因敲除小鼠在體模型廣泛應(yīng)用于肺循環(huán)的研究，對(duì)離體PASMCs培養(yǎng)技術(shù)提出了挑戰(zhàn)?；蚯贸齽?dòng)物皆為小鼠，如離體研究采用大鼠，則與在體研究無(wú)法匹配。離體小鼠PASMCs培養(yǎng)方法的研究成為十分迫切的研究課題。

肺細(xì)小動(dòng)脈較主動(dòng)脈或腸動(dòng)脈等其它體循環(huán)動(dòng)脈更難獲得，需要精密的儀器和熟練的分離技術(shù)，分離較多的肺細(xì)小動(dòng)脈量及剝離干凈纖維外膜在培養(yǎng)和純化中起了關(guān)鍵的作用。近年來(lái)對(duì)PASMCs的原代培養(yǎng)方法主要有組織貼壁法和酶消化法，但單純組織貼壁法培養(yǎng)周期長(zhǎng)且難傳代，本研究室結(jié)合前期較為成熟的大鼠PASMCs的原代培養(yǎng)方法［5］，建立了膠原酶 I消化結(jié)合血清鋪底法培養(yǎng)小鼠PASMCs，方法簡(jiǎn)單、酶消化時(shí)間易控制、培養(yǎng)周期短、重復(fù)性好，易于傳代，并發(fā)現(xiàn)低氧可以促進(jìn)小鼠PASMCs的增殖，抑制其凋亡。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，以下步驟需要注意:(1)乙醇浸泡小鼠過(guò)程中，注意使其頭向上，避免乙醇吸入氣管;(2)為保證得到充足的肺細(xì)小動(dòng)脈量，盡量分離并保留多級(jí)肺動(dòng)脈分支(圖6)，外膜盡可能剝離干凈;(3)傳代過(guò)程中棄除傳統(tǒng)的離心步驟減少對(duì)細(xì)胞損傷;(4)傳代后待細(xì)胞基本貼壁后及時(shí)換液，減少胰酶/EDTA對(duì)細(xì)胞的影響。

此外，增加肺細(xì)小動(dòng)脈組織量可以大大減少原代生長(zhǎng)時(shí)間;原代培養(yǎng)初期減少培養(yǎng)基量可以加速細(xì)胞的貼壁;PASMCs在培養(yǎng)瓶里較培養(yǎng)皿更容易貼壁生長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)更好。傳代后的小鼠PASMCs沒有像大鼠PASMCs典型的“峰-谷”樣生長(zhǎng)規(guī)律，而是大面積地鋪展開生長(zhǎng)，形態(tài)萬(wàn)千，但經(jīng)過(guò)鑒定仍為平滑肌細(xì)胞。小鼠PASMCs的形態(tài)不典型性影響研究者對(duì)傳代成功與否的判斷。

膠原酶I消化結(jié)合血清鋪底法培養(yǎng)小鼠PASMCs，是一種值得推廣的小鼠PASMCs體外培養(yǎng)方法，低氧可以促進(jìn)小鼠PASMCs的增殖，抑制其凋亡。

Figure 6.The separated pulmonary artery(×5).Ⅰ:primary branch;Ⅱ:secondary branch;Ⅲ:third branch;Ⅳ:fourth branch.圖6 各級(jí)肺動(dòng)脈

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