c-Myc抑制劑10058-F4對(duì)伊馬替尼耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用*

龍梓潔， 方志剛， 潘曉娜， 范蕊芳， 林東軍

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia， CML)是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其產(chǎn)生的大量白細(xì)胞在骨髓內(nèi)聚集，抑制骨髓的正常造血。目前，酪氨酸激酶小分子抑制劑伊馬替尼(imatinib)已經(jīng)成為治療CML的一線用藥，使得CML患者的5年生存率明顯提高，但是仍有部分患者對(duì)伊馬替尼缺乏敏感性，產(chǎn)生耐藥或復(fù)發(fā)［1］。因此，尋找新的有效治療方法克服CML對(duì)伊馬替尼的耐藥性成為當(dāng)前迫切需要解決的問(wèn)題。

myc基因編碼的蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。人類(lèi) c-myc基因定位于 8q24，c-Myc蛋白與Max蛋白形成異二聚體，異二聚體與靶基因的E-box DNA(5’-CACGTG-3’)區(qū)域結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄功能，調(diào)節(jié)下游基因［2］。c-Myc蛋白參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡、分化、腫瘤形成及腫瘤耐藥等各個(gè)過(guò)程，并參與了多種信號(hào)通路的調(diào)控，包括 Wnt/β-catenin、phosphatidylinositol 3-kinase/Akt(PI3K/Akt)和Ras GTPase/MAP kinase(Ras/MAPK)等。在乳腺癌、前列腺癌、胃腸道腫瘤和黑色素瘤等多種實(shí)體瘤以及血液腫瘤中均發(fā)現(xiàn)c-Myc的異常表達(dá)，且與腫瘤的分期和預(yù)后相關(guān)［3］。研究報(bào)道c-Myc在白血病的發(fā)病及疾病進(jìn)程中起關(guān)鍵作用［4］。鑒于c-Myc作為腫瘤治療靶點(diǎn)的潛在性，各研究機(jī)構(gòu)紛紛致力于c-Myc小分子抑制劑的研發(fā)。其中，10058-F4在多種腫瘤如肝癌以及白血病研究中均顯現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果［5-6］。本文旨在探討c-Myc小分子抑制劑10058-F4對(duì)K562及伊馬替尼耐藥的K562/G細(xì)胞的抑制作用，從而為臨床上治療CML提供新的治療策略。

材料和方法

1 主要試劑

胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，c-Myc小分子抑制劑10058-F4、c-Myc抗體及GAPDH抗體為Santa Cruz產(chǎn)品，甲磺酸伊馬替尼為Selleckchem產(chǎn)品，甲基纖維素為R＆D產(chǎn)品，其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞(購(gòu)自American Type Culture Collection)及伊馬替尼耐藥的K562/G細(xì)胞(由K562細(xì)胞通過(guò)逐漸增加伊馬替尼濃度培養(yǎng)篩選得到)用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分組。

2.2 Western blotting檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平 用細(xì)胞裂解液［20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，150 mmol/L NaCl，0.25%NP40，2.5 mmol/L sodium pyprophosphate，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L βglycerophosphate，1 mmol/L Na3VO4，1 mmol/L PMSF，1 mg/L leupeptin］提取K562及K562/G細(xì)胞總蛋白。用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量后，等量蛋白上樣，10%SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，I抗孵育，4℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記的II抗孵育1 h，于暗室中曝光。以glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)作為內(nèi)參照。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 K562及K562/G細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，分別進(jìn)行不同的處理，檢測(cè)前每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，離心棄上清液后，每孔加入150 μL DMSO溶解沉淀，于490 nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集細(xì)胞后，1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，后用70% 冰乙醇固定過(guò)夜，碘化丙啶 (propidium iodide，PI)染色后流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。

2.5 甲基纖維素克隆形成實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組及藥物處理組細(xì)胞(K562及K562/G)分別培養(yǎng)于甲基纖維素中，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)6 d后顯微鏡下觀察克隆。

2.6 Annexin V-PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 K562及K562/G細(xì)胞分別進(jìn)行不同的處理，檢測(cè)前每孔用500 μL binding buffer 重懸，加入 5 μL Annexin VFITC及5 μL PI，避光孵育15 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較分析用t檢驗(yàn)或方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 伊馬替尼對(duì)K562及K562/G細(xì)胞的作用

將K562及K562/G細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板，分別用不同劑量(0、0.1、0.5、1、5、10 μmol/L)的伊馬替尼進(jìn)行處理，48 h后MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。與對(duì)照組相比，伊馬替尼可劑量依賴(lài)性地抑制K562及K562/G細(xì)胞的增殖。K562細(xì)胞對(duì)伊馬替尼較敏感，而K562/G在同樣劑量的伊馬替尼處理下出現(xiàn)耐藥。1 μmol/L的伊馬替尼作用下，K562細(xì)胞的存活率是53.9% ±2.0%，K562/G的存活率為77.4% ±5.9%(P＜0.01)，見(jiàn)圖1A。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，K562/G細(xì)胞比K562細(xì)胞表達(dá)更高的c-Myc蛋白，見(jiàn)圖1B。

2 c-Myc抑制劑10058-F4對(duì)K562及K562/G細(xì)胞增殖及周期的影響

由于c-Myc在K562/G細(xì)胞中具有較高的表達(dá)，為了驗(yàn)證c-Myc靶向抑制劑10058-F4對(duì)耐藥細(xì)胞的作用，10058-F4 以不同濃度(0、25、50、100 μmol/L)及不同時(shí)間(0、24、48、72 h)作用于K562及K562/G細(xì)胞，MTT法分析10058-F4對(duì)白血病細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，10058-F4對(duì)K562及K562/G細(xì)胞均有抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性，并且對(duì)耐藥的K562/G細(xì)胞較K562細(xì)胞抑制作用更強(qiáng)，耐藥細(xì)胞對(duì)10058-F4更敏感，見(jiàn)圖2。50 μmol/L的10058-F4作用48 h，K562及K562/G細(xì)胞的存活率分別為73.3%±3.2%及63.7%±3.0%;100 μmol/L 的 10058-F4 作用 48 h，K562 及K562/G細(xì)胞的存活率分別為61.7%±3.6%及42.0%±3.2%，與對(duì)照組相比均具有顯著差異(P＜0.01)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)K562及K562/G細(xì)胞周期結(jié)果顯示，10058-F4能阻滯細(xì)胞于G0/G1期(圖3)，因此10058-F4對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用可能與細(xì)胞周期的阻滯相關(guān)。

Figure 2.10058-F4 inhibited proliferation of K562 and K562/G cells.A:K562 and K562/G cells were treated with various concentrations of 10058-F4 for 48 h and then subjected to MTT assay;B:K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 for indicated time and then subjected to MTT assay.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L or 0 h.圖2 10058-F4抑制K562及K562/G細(xì)胞的增殖

3 c-Myc抑制劑10058-F4促進(jìn)K562及K562/G細(xì)胞凋亡

100 μmol/L的10058-F4處理 K562及 K562/G細(xì)胞48 h后，Annexin V-PI染色并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明10058-F4可促使K562及K562/G細(xì)胞發(fā)生凋亡，見(jiàn)圖4。

4 c-Myc抑制劑10058-F4對(duì)K562及K562/G細(xì)胞克隆形成能力的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于K562細(xì)胞，K562/G細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的克隆形成能力(P＜0.01)，見(jiàn)圖5。伊馬替尼對(duì)于K562細(xì)胞的抑制作用明顯大于K562/G細(xì)胞(P＜0.01)，進(jìn)一步表明K562/G細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的耐藥性。10058-F4可抑制K562及 K562/G細(xì)胞的克隆形成能力，且對(duì)K562/G細(xì)胞的作用更加顯著(P＜0.01)。10058-F4與伊馬替尼聯(lián)合作用于細(xì)胞6 d后，兩藥聯(lián)用組比對(duì)照組及單藥組作用效果更加明顯，提示10058-F4可以逆轉(zhuǎn)K562/G細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的耐藥性。

Figure 3.10058-F4 induced cell cycle arrest in K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 for 48 h and then subjected to flow cytometry for cell cycle analysis.Mean±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control.圖3 10058-F4導(dǎo)致K562及K562/G細(xì)胞周期阻滯

討 論

作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，c-Myc在人類(lèi)多種實(shí)體腫瘤及血液腫瘤中異常高表達(dá)。研究報(bào)道，c-Myc的異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的形成和進(jìn)展［7］;抑制c-Myc的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、衰老和分化。更重要的是，c-Myc的高表達(dá)在白血病發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵的作用［8］，抑制c-Myc能夠阻止白血病的發(fā)生［9］。c-Myc通過(guò)調(diào)節(jié)一系列下游基因決定細(xì)胞的存活。c-Myc在CML患者的CD34+造血前體細(xì)胞中通過(guò)調(diào)控ATP-binding cassette(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄從而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥［10］。另外，c-Myc可調(diào)節(jié)多種micro RNA，包括增加促進(jìn)腫瘤發(fā)生的microRNA及降低腫瘤抑制作用的micro-RNA的表達(dá)。在K562細(xì)胞中，c-Myc可通過(guò)調(diào)控miR-144/451的表達(dá)使K562細(xì)胞獲得對(duì)伊馬替尼的抗藥性［11］。

Figure 4.10058-F4 induced apoptosis of K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 100 μmol/L 10058-F4 for 48 h and then subjected to flow cytometry for Annexin V-PI analysis.Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control.圖4 10058-F4促進(jìn)K562及K562/G細(xì)胞發(fā)生凋亡

本研究發(fā)現(xiàn)c-Myc表達(dá)上調(diào)是耐藥細(xì)胞克隆形成能力增強(qiáng)的細(xì)胞遺傳學(xué)特征之一，c-Myc的高表達(dá)可能導(dǎo)致K562/G細(xì)胞對(duì)于伊馬替尼的敏感性降低。c-Myc抑制劑10058-F4可抑制K562及K562/G細(xì)胞的增殖，并且對(duì)K562/G細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的殺傷作用，可能與其高表達(dá)c-Myc相關(guān)。細(xì)胞周期檢測(cè)顯示10058-F4能阻滯細(xì)胞于G0/G1期，因此10058-F4抑制細(xì)胞增殖可能與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)，與之前的研究結(jié)果一致［6］。同時(shí)，10058-F4可促進(jìn)K562及K562/G細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，K562/G細(xì)胞對(duì)10058-F4具有更高的敏感性。在肝癌［5］、肺癌［12］及黑色素瘤［13］的研究中，抑制 c-Myc的表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。我們的研究發(fā)現(xiàn)10058-F4可恢復(fù)耐藥K562/G細(xì)胞對(duì)于伊馬替尼的敏感性，減少細(xì)胞的克隆形成數(shù)目。因此，高表達(dá)c-Myc的K562/G細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)c-Myc的表達(dá)增強(qiáng)對(duì)伊馬替尼的抵抗作用，提高細(xì)胞的耐藥性。10058-F4作為一個(gè)有效的c-Myc的小分子抑制劑，可殺傷白血病細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)耐藥。

Figure 5.10058-F4 supressed colony formation of K562 and K562/G cells.K562 and K562/G cells were treated with 50 μmol/L 10058-F4 or/and 1 μmol/L imatinib for 6 d and subjected to colony formation analysis(×100).＊＊P＜0.01 vs K562;##P＜0.01 vs imatinib.圖5 10058-F4抑制K562及K562/G細(xì)胞的克隆形成能力

本實(shí)驗(yàn)初步分析了c-Myc對(duì)CML耐藥細(xì)胞特性的影響。結(jié)果表明c-Myc在CML細(xì)胞耐藥性中起重要作用，c-Myc的小分子抑制劑可有效殺傷K562細(xì)胞及伊馬替尼耐藥的K562/G細(xì)胞，預(yù)示通過(guò)抑制c-Myc的表達(dá)可以克服CML治療過(guò)程中的耐藥問(wèn)題，為臨床提供新的治療策略。

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