徐中菊， 張 悅， 舒 適， 張瑞義

糖尿病腎病是糖尿病臨床常見的并發(fā)癥，也是糖尿病患者的主要致死致殘原因之一［1］。臨床采用中藥防治糖尿病腎病效果顯著，許多研究也證實中藥防治糖尿病腎病具有多靶點、多途徑、多環(huán)節(jié)的作用特點，能有效控制和延緩腎功能惡化［2］。本研究通過觀察真武湯(Zhenwu decoction，ZWD)對鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)所致糖尿病腎病大鼠的腎功能、24 h尿蛋白定量及腎組織病理改變等影響，明確真武湯防治糖尿病腎病的作用效果，為真武湯在糖尿病腎病的臨床應用提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 健康 SPF級雄性 SD大鼠［220±20］g61只，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物許可證號為［SCXK(滬)2008-0016］。

1.2 藥物 真武湯制備:按茯苓9 g，芍藥9 g，白術6 g，生姜9 g，附子9 g的比例，由上海中醫(yī)藥大學中藥所制成生藥量1.2 kg/L濃縮液備用。

1.3 主要試劑 RIPA裂解液(北京普利萊基因技術有限公司，C1053);苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF;Amresco);丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)試劑盒(南京建成生物有限公司);磷酸酶抑制劑混合物Ⅱ(生工生物工程有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(Pierce);兔單抗NF-κB(Cell Signaling);小鼠單抗 α-平滑肌肌動蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA;Sigma);小鼠單抗 GAPDH(上?？党缮锕こ坦?;蛋白Marker(Fermentas);Tween-20和ECL化學發(fā)光試劑盒(碧云天)。1.4 主要儀器 雅培血糖儀(Optium Xceed)及快速血糖試紙(雅培公司)，倒置熒光顯微鏡(Olympus)，全自動熒光成像系統(tǒng)(HR16)，全自動生化分析儀(Hitachi)，全波長酶標儀(BioTek Power Wave XS2)，紫外透射分析儀 (復日科技FR-200紫外與可見分析裝置)。

2 方法

2.1 糖尿病腎病模型的制備與分組給藥 全部大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組(normal)16只和造模組(STZ)45只，造模組禁食12 h，按60 mg/kg一次性腹腔注射STZ。標準飲食喂養(yǎng)，自由飲水。1周后，尾靜脈取血測量大鼠空腹血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病模型大鼠。模型大鼠根據(jù)血糖隨機分為模型組(STZ，22只)和真武湯治療組(STZ+ZWD，23只)，分別給予真武湯生藥 3 g·kg－1·d－1，模型組和正常組給予等量蒸餾水灌胃。

2.2 標本收集 治療第8周末收集24 h尿液并記錄24 h尿量，作24 h尿蛋白定量檢測;取材，處死大鼠前稱重，以3%戊巴比妥鈉(購自上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心)按2 mL/kg體重的劑量腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，測血糖(glucose，GLU)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，SCr)等生化指標，取雙側腎臟，用濾紙吸干腎表面血液后稱重，取部分腎組織固定于4%甲醛中用于石蠟切片制備。

3 指標測定

3.1 腎系數(shù)的測定 腎系數(shù)(%)=兩側腎重和(g)/體重(kg)×100%。

3.2 24 h 尿蛋白總量(total protein，TP)、SCr、BUN和GLU測定 全自動生化儀測定。

3.3 大鼠腎組織氧化應激指標SOD活性、MDA及iNOS含量測定 稱取約100 mg－80℃保存的腎組織，放入1.5 mL的Ep管中，加入生理鹽水1 mL，于超聲破碎儀中(冰浴)勻漿3次，4℃、2 500 r/min離心15 min;吸取上清置于另一1.5 mL的Eppendorf管，按照BCA蛋白定量試劑盒操作步驟進行蛋白定量，以測算其蛋白濃度，另按照試劑盒說明書測定SOD、MDA和iNOS吸光度，根據(jù)公式計算 SOD活性、MDA及iNOS含量。

3.4 腎臟病理檢查 取腎皮質，4%中性甲醛固定，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、制成3 μm石蠟切片，HE染色后光鏡觀察。

3.5 腎組織 α-SMA和 NF-κB蛋白表達測定 取－80℃保存的腎組織約100 mg，置入1.5 mL的Eppendorf管中，加入預冷的裂解緩沖液1 mL，于超聲破碎儀中(冰浴)勻漿3次后置于冰上20 min;4℃、12 000 r/min離心15 min;吸取上清置于另一1.5 mL的Eppendorf管中，－80℃保存2 d，解凍后12 000 r/min離心15 min，取上清即為所提取的蛋白溶液。取少量上清液按照BCA蛋白定量試劑盒操作步驟進行定量。將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合加2×載樣緩沖液后于100℃煮沸變性5 min，保存于－20℃冰箱。

將變性好的組織樣品冰浴5 min后上樣，每孔加10 μg蛋白樣品，積層膠電壓80 V，分離膠電壓120 V電泳。電泳結束后，轉膜1h(經(jīng)甲醇處理的PVDF膜)，將轉有蛋白的PVDF膜置于5%BSA封閉1 h后，置于I抗(α-SMA及 NF-κB抗體分別用封閉液1∶2 000稀釋，GAPDH 抗體按1∶5 000稀釋)中，置4℃搖床振蕩過夜，1×TBS洗4次，每次8 min。置HRP標記的Ⅱ抗(用封閉液1∶5 000稀釋)中孵育2 h，1×TBS洗4次，每次8 min，在暗室取ECL A和B試劑1∶1混合后覆蓋膜上，1.5 min后棄去化學發(fā)光試劑，將膜放入暗盒內，用X光膠片進行曝光、顯影及定影。復日科技FR-200紫外與可見分析裝置圖像分析系統(tǒng)掃描Western blotting條帶的灰度，計算目的蛋白與內參照的比值(相對灰度值)。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 16.0軟件分析，計量資料采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 一般情況

大鼠自造模之日起出現(xiàn)多飲、多食、多尿，體重減輕，精神萎靡，活動倦怠，毛發(fā)雜亂泛黃偶有脫毛。

2 各組大鼠體重和腎系數(shù)的變化

與正常大鼠比較，模型大鼠腎系數(shù)明顯升高(P ＜0.01)，體重明顯下降(P ＜0.01);真武組大鼠的腎系數(shù)顯著低于模型組 (P＜0.05)，體重則無顯著差異，見表1。

表1 各組大鼠體重和腎系數(shù)比較Table 1.Comparison of the body weight and renal coefficient of the rats in different groups(Mean±SD)

3 各組大鼠生化指標的比較

造模大鼠的24 h尿蛋白定量、血尿素氮、血清肌酐和血糖均顯著高于正常組(P＜0.05)，說明大鼠糖尿病腎病模型建立成功;真武組24 h尿蛋白、尿素氮、肌酐和血糖明顯低于模型組(P＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠生化指標比較Table 2.Comparison of TP and biochemical indicators in different groups(Mean ±SD)

4 各組大鼠腎組織SOD、MDA及iNOS水平比較

與正常組比較，模型組 SOD活顯著性降低、MDA含量顯著升高(P＜0.05)，真武組MDA含量低于模型組，出現(xiàn)顯著差異(P＜0.05)，iNOS活性高于模型組(P ＜0.05)，見表3。

表3 各組大鼠腎組織SOD、MDA和iNOS測定結果的比較Table 3.Comparison of SOD，MDA and iNOS in different groups(Mean±SD)

5 各組大鼠腎組織病理變化

HE染色可見正常大鼠腎組織形態(tài)正常，小球形態(tài)規(guī)則，小管排列緊密整齊，腎小管上皮細胞形態(tài)正常。模型大鼠腎小球肥大、毛細血管基底膜增厚，系膜基質增生，腎小管上皮細胞空泡樣變，可見蛋白管型，腎間質纖維組織增生明顯;真武組腎小球形態(tài)基本正常，僅有少量腎小管上皮細胞空泡樣變，偶有蛋白管型，病變明顯輕于模型組，見圖1。

6 真武湯對糖尿病腎病大鼠α-SMA及NF-κB蛋白表達的影響

模型大鼠腎組織α-SMA蛋白的水平明顯高于正常組(P＜0.05)，STZ+ZWD組大鼠的腎組織α-SMA蛋白水平明顯低于STZ組(P＜0.05)，見圖2。

模型大鼠腎組織NF-κB蛋白的水平明顯高于正常組(P＜0.05)，STZ+ZWT組大鼠的腎組織NF-κB 蛋白水平明顯低于STZ組(P＜0.05)，見圖3。

Figure 1.The pathological changes of renal tissues in rats(HE staining，×400).A:normal;B:STZ;C:STZ+ZWD.圖1 各組大鼠組織病理變化

Figure 2.Protein expression of α-SMA detected by Western blotting.Mean± SD.n=3.*P ＜0.05 vs nomal;#P ＜0.05 vs STZ group.圖2 各組大鼠α-SMA蛋白的表達

討 論

中醫(yī)無糖尿病腎病病名，《素問，病機氣宜保命集》有“腎消者，病在下焦，初發(fā)為膏淋，下如膏油之狀，至成而面色黧黑，形瘦而耳焦，小便濁而有脂”的記載，將該病稱為“腎消”為宜;《靈樞·五變》說:“五臟皆柔弱者，善病消癉”，指出五臟虛弱是發(fā)生本病的重要因素。歷代醫(yī)家將按其臨床癥狀將之歸于中醫(yī)“消渴”、“水腫”、“尿濁”、“腎勞”“關格”等證?！妒備洝吩?消渴病久腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，小便至甜，有膏，揭示了糖尿病腎病尿液的變化。

現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，糖尿病腎病是由于糖代謝紊亂及其所導致的血流動力學、細胞因子、生長因子等多種因素綜合作用的結果。其中氧化應激反應增強、活性氧族(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增多，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要的作用［3］。近年來體內外實驗研究表明，高血糖可以影響大鼠腎臟組織中抗氧化酶的表達，升高糖尿病大鼠腎臟組織的氧化應激水平，在糖尿病腎病發(fā)病機制中起重要作用［4］，同時還可以激活NF-κB的活性。NF-κB作為一種核轉錄調節(jié)因子，能與多種細胞基因的啟動子和增強子中的κB序列位點特異結合，參與免疫反應、淋巴細胞分化、生長控制、細胞內信號傳遞、調節(jié)體內眾多細胞因子和炎癥介質基因的表達。高糖通過 ROS激活 NF-κB，NF-κB再促進系膜細胞單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)基因轉錄，上調 MCP-1的表達，導致腎組織炎癥的發(fā)生、發(fā)展;也有報道，腫瘤壞死因子可激活SD大鼠腎小球系膜細胞NF-κB，并誘導血管緊張素原表達及血管緊張素Ⅱ產(chǎn)生和增加［5］，而抑制NF-κB活性不但可以可降低腎組織血管緊張素Ⅱ含量，還延緩實驗性糖尿病大鼠腎病的發(fā)生［6］。同時，高血糖誘導的ROS還能增加細胞外基質的合成，促使腎小球肥大，從而誘導纖連蛋白、膠原和轉化生長因子β1等表達增加［7-9］，促進系膜細胞表達α-SMA而發(fā)生表型轉化［10］，使系膜細胞能夠產(chǎn)生更多I、Ⅲ、Ⅳ型膠原，纖連蛋白及層黏連蛋白，從而進一步加劇腎臟的纖維化。

真武湯出自《傷寒論》，是治療脾腎陽虛、水濕泛濫的代表方劑。方中炮附子溫腎復陽，白術健脾制水，茯苓淡滲利水，生姜宣散水氣，四味相配共奏溫陽利水之功，在各種原因引起的陽虛腎病中運用廣泛。實驗研究也證實該方能顯著增強自由基清除能力，減少受自由基攻擊的脂質過氧化產(chǎn)物［11］;減少阿霉素腎病大鼠腎組織羥脯氨酸含量，改善腎功能及減輕病理損傷［12］;明顯改善醋酸氫化可的松腎陽虛大鼠的腎功能，改善腎小球濾過膜的通透性，促使代謝產(chǎn)物肌酐、尿素氮的排出，減少血漿白蛋白的大量丟失［13］。

為進一步探討真武湯防治糖尿病腎病機制，我們采用60 mg/kg劑量的STZ［14］大鼠腹腔注射的方法復制了糖尿病腎病大鼠模型。造模后模型動物出現(xiàn)血糖增高和蛋白尿，腎組織病理切片出現(xiàn)腎小球肥大，毛細血管基底膜增厚，系膜基質增生，腎小管上皮細胞空泡樣變，蛋白管型，腎間質纖維組織增生等，表明模型制備成功。經(jīng)真武湯水煎劑灌胃治療8周后，治療組大鼠的一般情況及腎功能均有所改善，腎纖維化程度也較模型組顯著減輕，提示真武湯能有效防治糖尿病腎病的腎纖維化。與正常組比較，模型大鼠SOD顯著降低，MDA顯著升高，提示脂質過氧化損傷了糖尿病大鼠腎組織并加重糖尿病腎病進程。真武湯組MDA顯著低于模型組(P＜0.05)，iNOS顯著高于模型組(P＜0.05)，模型大鼠腎組織α-SMA及NF-κB蛋白的水平明顯高于正常組(P＜0.05)，STZ+ZWD組大鼠的腎組織α-SMA蛋白水平明顯低于STZ組(P＜0.05)，表明真武湯可通過降低血糖，抑制肌成纖維細胞的形成，減少細胞外基質的產(chǎn)生，抑制NF-κB蛋白的表達來提高腎臟抗氧化損傷的作用，減輕糖尿病腎病時腎臟局部氧化應激反應等環(huán)節(jié)發(fā)揮腎臟保護作用，減少蛋白尿并改善糖尿病腎病大鼠腎功能從而延緩糖尿病腎病的病程。

［1］ Sasso FC，De Nicola L，Carbonara O，et al.Cardiovascular risk factors and disease management in type 2 diabetic patients with diabetic nephropathy［J］.Diabetes Care，2006，29(3):498-503.

［2］ 鐘 建，史 偉，吳金玉，等.腎纖維化的中醫(yī)機制及其干預靶點［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2010，37(9):1695-1696.

［3］ Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications:a unifying mechanism［J］.Diabetes，2005，54(6):1615-1625.

［4］ 李曉博，牟忠卿，陳 麗，等.糖尿病大鼠腎臟組織氧化應激及其在糖尿病腎病發(fā)病中的意義［J］.中國病理生理雜志，2006，22(4):806-809.

［5］ 郭 穎，李 津，陳黎紅，等.抑制核因子-κB活性對TNF-a誘導的腎小球系膜細胞血管緊張素原表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2009，25(9):1782-1785.

［6］ 丁鶴林，黎 鋒，徐明彤，等.抑制核因子-κB對糖尿病腎病的作用［J］.中華內科雜志，2002，41(9):605-609.

［7］ Catherwood MA，Powell LA，Anderson P，et al.Glucose-induced oxidative stress in mesangial cells［J］.Kidney Int，2002，61(2):599-608.

［8］ Iglesias-De La Cruz MC，Ruiz-Torres P，Alcamí，et al.Hydrogen peroxideincreasesextracellularmatrix mRNA through TGF-beta in human mesangial cells［J］.Kidney Int，2001，59(1):87-95.

［9］ Chang JM ，Kuo MC，Kuo HT，et al.Increased glomerular and extracellular malondialdehyde levels in patients and rats with diabetic-ephmpathy［J］.Lab Clin Med，2005，146(4):210-215.

［10］ Simonson MS.Phenotypic transitions and fibrosis in diabetic nephropathy［J］.Kidney Int，2007，71(9):846-854.

［11］王鈺霞，陳魁敏，郝 偉，等.真武湯對陽虛小鼠作用的實驗研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2001，7(1):48-49.

［12］李亞麗，李志杰，張 燕，等.真武湯對阿霉素所致大鼠腎損傷的治療作用［J］.中國病理生理雜志，2013，29(11):1994-2000.

［13］梁華龍，李姍姍，郭 芳，等.真武湯利水作用機制的實驗研究［J］.北京中醫(yī)藥大學學報，1999，22(2):68-70.

［14］李 偉，張 紅，殷松樓，等.不同劑量鏈脲佐菌素誘導SD大鼠糖尿病腎病模型的研究［J］.徐州醫(yī)學院學報，2006，26(1):52-55.