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      急性冠脈綜合征患者介入術(shù)后可視化血液流變性與血小板功能的相關(guān)性分析*

      2014-11-08 02:27:48王家琪劉劍剛王承龍
      中國(guó)病理生理雜志 2014年2期
      關(guān)鍵詞:回歸系數(shù)心血管病血小板

      王家琪, 劉劍剛, 王承龍

      急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)是一組由急性心肌缺血引起的臨床綜合征,包括急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)及不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina,UA)。中國(guó)多省市心血管病危險(xiǎn)因素隊(duì)列研究結(jié)果顯示,我國(guó)急性冠脈綜合征的發(fā)病率和死亡率均呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。目前,經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)是改善ACS臨床癥狀較為有效的方法之一。但是,患者PCI術(shù)后康復(fù)期間對(duì)于康復(fù)訓(xùn)練、治療、健康生活習(xí)慣等重視不夠而導(dǎo)致新的血管病變時(shí)刻影響著患者的遠(yuǎn)期預(yù)后??梢暬毫髯冃詸z測(cè)儀(micro-channel array flow analyzer,MCFAN)采用半導(dǎo)體技術(shù)和仿生技術(shù),可以實(shí)時(shí)檢測(cè)血液流動(dòng)的狀況。目前,MC-FAN在國(guó)內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于血脂代謝異常、高血壓、糖尿病等患者及亞健康人群的血液檢測(cè)[2-3]。課題組前期應(yīng)用MC-FAN觀測(cè)血脂代謝異常的患者,發(fā)現(xiàn)高密度脂蛋白與血液通過(guò)時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[4],而對(duì)ACS介入術(shù)后患者的研究還未見(jiàn)報(bào)道。氯吡格雷和阿司匹林治療是抗血小板治療的基礎(chǔ),也是ACS患者介入術(shù)后預(yù)防心血管事件的重要手段,ACS患者介入術(shù)后的血液流動(dòng)狀況和血小板功能變化如何?是否發(fā)生抗血小板藥物抵抗?并據(jù)此提出合理規(guī)范的個(gè)體化治療方案是目前臨床面臨的新課題。本研究通過(guò)MC-FAN觀察ACS介入術(shù)后一年以上患者可視化血液的流變性,為進(jìn)一步的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

      材料和方法

      1 一般資料

      選擇2008年~2010年因ACS在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院等13所醫(yī)院接受介入術(shù)治療后處于穩(wěn)定期的患者74例,其中男58例,女16例,最大年齡76歲,最小年齡44歲,平均年齡(62.54±7.79)歲。另外選取體檢正常21人作為健康對(duì)照組,其中男16人,女5人,最大年齡76歲,最小年齡52歲,平均年齡(61.38±7.43)歲。2組間性別、年齡和體重比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

      2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

      ACS診斷標(biāo)準(zhǔn)采用中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)、中華心血管病雜志編輯委員會(huì)2007年公布的《不穩(wěn)定性心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南》[5],及2010年公布的《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》[6]。

      3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

      除外合并嚴(yán)重肝腎系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等原發(fā)性疾病及精神病、惡性腫瘤患者,有嚴(yán)重認(rèn)知障礙者,妊娠期或哺乳婦女,需持續(xù)機(jī)械輔助性治療的患者,及拒絕簽署知情同意書(shū)者。健康人均經(jīng)本院健康體檢,并參照《中華醫(yī)學(xué)會(huì)老年醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)對(duì)健康老年人標(biāo)準(zhǔn)的建議》[7]納入。

      4 試劑與儀器

      血小板聚集誘導(dǎo)劑二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP;0.2 mmol/L)為 Biopool International生產(chǎn);血小板 P-選擇素(P-selectin)ELISA試劑盒、血小板衍生生長(zhǎng)因子BB(platelet derived growth factor BB,PDGF-BB)ELISA試劑盒和血管假性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)ELISA試劑盒由Abcam生產(chǎn)。

      MC-FAN(HR300型)由日本MC-FAN研究所生產(chǎn),北京咸通佳儀科技發(fā)展有限公司提供;XSN-RII型血小板黏附測(cè)定儀由江蘇省無(wú)錫電子儀器二廠生產(chǎn);LBY-NJ2型血小板聚集儀由北京普利生公司生產(chǎn);Thermo Multiskan MK3型酶標(biāo)儀由Labsystems生產(chǎn)。

      MC-FAN儀是由在硅晶片上制成4 700個(gè)6 μm的溝槽來(lái)模擬人體毛細(xì)血管。將離體肝素抗凝血液放入儀器,儀器以200 mmH2O的恒定壓力推動(dòng)200 μL血液經(jīng)過(guò)模擬人體毛細(xì)血管,同時(shí)通過(guò)彩色顯微攝像機(jī)將血液通過(guò)模擬毛細(xì)血管過(guò)程中的紅細(xì)胞變形、白細(xì)胞附壁運(yùn)動(dòng)、血小板聚集、血小板黏附以及血流和模擬血管的關(guān)系等情況放大反映在電腦顯示屏上(用實(shí)際觀測(cè)的血液細(xì)胞流動(dòng)圖像取代了傳統(tǒng)衍射模擬圖像),并且使我們?cè)谇逦乜吹窖?xì)胞流動(dòng)快慢和變形能力的同時(shí),也動(dòng)態(tài)地記錄了10~100 μL血液通過(guò)模擬毛細(xì)血管的時(shí)間[8]。

      5M C-FAN檢測(cè)

      采用橫斷面研究,將ACS介入術(shù)后患者作為實(shí)驗(yàn)組,健康人作為健康對(duì)照組,比較兩組間指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果是否存在差異;在實(shí)驗(yàn)組內(nèi)觀察血液流變性可視化檢測(cè)儀測(cè)得的血流通過(guò)時(shí)間(micro-channel array flow analyzer transiting time,MC-FAN TT)與血小板功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果是否存在相關(guān)性。參與研究者于上午8~10點(diǎn)空腹、靜息狀態(tài)下采集肘靜脈血5 mL,1%肝素抗凝全血,室溫(25℃)1 h內(nèi)應(yīng)用MCFAN觀察血液流動(dòng)情況,并檢測(cè)MC-FAN TT(單位:s)。

      6 血小板功能檢測(cè)

      血小板黏附實(shí)驗(yàn)(platelet adhesiveness test,PAdT)采用旋轉(zhuǎn)玻球法,取靜脈血2.7 mL,置于含0.129 mol/L枸櫞酸鈉溶液0.3 mL的真空離心管中,輕輕混勻;立即用微量注射器取血標(biāo)本1.1 mL,置球形瓶?jī)?nèi),將球形瓶置于轉(zhuǎn)動(dòng)裝置上,以3.8 r/min的速度轉(zhuǎn)動(dòng)15 min,使血液與瓶壁充分接觸;分別從真空離心管中(接觸前)和球形瓶中(接觸后)準(zhǔn)確地吸取血10 μL進(jìn)行血小板計(jì)數(shù),血小板黏附率(%)=(血小板黏附前計(jì)數(shù)-血小板黏附后計(jì)數(shù))/黏附前計(jì)數(shù)×100%;血小板聚集實(shí)驗(yàn)(platelet aggregation test,PAgT)采用比濁法,用硅化或一次性注射器從患者肘靜脈順利取血2.7 mL,注入含0.129mol/L枸櫞酸鈉0.3 mL的真空離心管中;以1 000 r/min離心10 min,取出上層富含血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP),計(jì)數(shù)血小板并調(diào)至250×109/L;將剩余血液以3 000 r/min離心20 min,上層較為透明的液體即為PRP,調(diào)節(jié)血小板至(10~20)×109/L;將PRP標(biāo)本放入測(cè)定孔調(diào)節(jié)透光度為10%,并加攪拌磁棒,在37℃預(yù)熱3 min;在PRP中加入誘導(dǎo)劑,同時(shí)開(kāi)始攪拌(1 000 r/min),記錄聚集波形圖,計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算血小板(1~5 min)最大聚集率;采用ELISA檢測(cè)血小板P-selectin、PDGF-BB及vWF。

      7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析組間關(guān)系;采用相關(guān)分析及多元線性回歸分析,分析血液流經(jīng)時(shí)間的變化與血小板功能指標(biāo)的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      結(jié) 果

      1 2組患者基線分析

      納入研究對(duì)象共95例,其中ACS介入術(shù)后組74例,健康對(duì)照組21例。經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn),各組間年齡、性別等基本資料的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05),2組數(shù)據(jù)具有可比性,見(jiàn)表1。

      表1 2組間年齡及性別的比較Table 1.The comparison of age and sex between the two groups

      2 ACS介入術(shù)后組和健康對(duì)照組的MC-FAN結(jié)果比較

      健康組在 10 μL、30 μL、60 μL 和100 μL 4 個(gè)容量(或體積)的血液通過(guò)模擬人體毛細(xì)血管的時(shí)間分別為(6.96 ±1.38)s、(21.71 ±2.82)s、(49.25 ±6.36)s和(80.57 ±5.01)s。與健康組比較,ACS 介入組的紅細(xì)胞變形能力相對(duì)減弱,經(jīng)MC-FAN測(cè)得的血液 MC-FAN TT顯著延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖1和表2。

      3 ACS介入術(shù)后組和健康對(duì)照組的血小板功能指標(biāo)比較

      與健康組比較,ACS介入術(shù)后患者的血小板最大聚集率、血小板黏附率、血小板P-選擇素和PDGFBB指標(biāo)均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。2組的vWF所測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),見(jiàn)表3。

      4 ACS介入術(shù)后患者各血小板功能指標(biāo)與MCFAN TT的相關(guān)性分析

      MC-FAN所測(cè)10 μL血液 MC-FAN TT與 P-selectin、PDGF-BB、vWF和 PAdT的值呈正相關(guān)(P<0.01),與 PAgT 的值呈正相關(guān)(P <0.05);30 μL 血液MC-FAN TT與P-selectin的值呈正相關(guān)(P<0.01),與 PDGF-BB和 vWF的值呈正相關(guān)(P<0.05);60 μL血液MC-FAN TT與PAgT的值呈正相關(guān)(P<0.01),與P-selectin和vWF的值呈正相關(guān)(P<0.05);100 μL 血液 MC-FAN TT 與 PAgT 和 PAdT的值呈正相關(guān)(P<0.05),見(jiàn)表4。

      Figure 1.The MC-FAN pictures of acute coronary syndrome(ACS)group and normal group.圖1 MC-FAN顯示 ACS介入術(shù)后患者和正常人群10 μL、30 μL、60 μL和100 μL 血液流動(dòng)的圖像

      表22 組MC-FAN TT的比較Table 2.The comparison of MC-FAN TT between the two groups(s.Mean±SD)

      表3 2組間血小板功能指標(biāo)的比較Table 3.The comparison of platelet function indexes between the two groups(Mean±SD)

      表4 ACS介入術(shù)后患者各血小板功能指標(biāo)與MC-FAN TT的相關(guān)性比較Table 4.The correlations between platelet function indexes and MC-FAN TT in 74 patients with ACS after PCI

      以10 μL血液MC-FAN TT為因變量,以P-selectin、PDGF-BB、vWF、PAdT 和 PAgT 的數(shù)值為自變量,代入多元線性回歸模型,并采用逐步回歸法對(duì)自變量進(jìn)行篩選(α入=0.10,α出=0.15),P-selectin 和PAdT被選入,PAgT、PDGF-BB和vWF被剔除,得出多元線性回歸方程為 y=0.72+0.281x1+0.12x2。P-selectin的偏回歸系數(shù)為0.281,標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)0.626(P <0.01),與10 μL 血液 MC-FAN TT 顯著相關(guān)(P <0.01)。PAdT 的偏回歸系數(shù)為 0.120,標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)0.272(P <0.05),與 10 μL 血液 MC-FAN TT顯著相關(guān)(P <0.05)。

      以30 μL血液MC-FAN TT為因變量,以P-selectin、PDGF-BB和vWF的數(shù)值為自變量,代入多元線性回歸模型,并采用逐步回歸法對(duì)自變量進(jìn)行篩選(α入=0.10,α出=0.15),P-selectin 被選入,PDGFBB和 vWF被剔除,得出線性回歸方程為 y=17.56+0.829x。P-selectin 的偏回歸系數(shù)為 0.829,標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)0.334(P <0.01),與 30 μL 血液 MCFAN TT顯著相關(guān)(P <0.01)。

      以60 μL血液MC-FAN TT為因變量,以PAgT、P-selectin和vWF的值為自變量,代入多元線性回歸模型,并采用逐步回歸法對(duì)自變量進(jìn)行篩選(α入=0.10,α出=0.15),PAgT 和 P-selectin 被選入,vWF被剔除,得出多元線性回歸方程為y=-11.977+0.916x1+2.263x2。PAgT 的偏回歸系數(shù)為 0.916,標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù) 0.573(P <0.01),與 60 μL血液 MCFAN TT顯著相關(guān)(P<0.01)。P-selectin的偏回歸系數(shù)為2.263,標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)0.495(P <0.05),與60 μL血液MC-FAN TT顯著相關(guān)(P<0.01)。

      以100 μL血液MC-FAN TT為因變量,以PAgT和PAdT的值為自變量,代入多元線性回歸模型,并采用逐步回歸法對(duì)自變量進(jìn)行篩選(α入=0.10,α出=0.15),PAdT被選入,PAgT 被剔除,得出線性回歸方程為y=19.252+3.276x。PAgT的偏回歸系數(shù)為3.276,標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)0.815(P <0.05),與100 μL血液MC-FAN TT顯著相關(guān)(P<0.05)。

      討 論

      目前,ACS患者的最有效治療手段之一,即為經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療。但是,介入治療在改善患者心功能的同時(shí),可對(duì)靶血管造成一定的損傷[9],血液流變性的變化被認(rèn)為是損傷的直接表現(xiàn)之一。由于現(xiàn)有臨床研究人群差異較大,支架類型、用藥時(shí)間及劑量等亦存在差異,個(gè)體化治療方案逐漸成為未來(lái)ACS時(shí)程選擇的方向。應(yīng)用MC-FAN對(duì)ACS介入術(shù)后患者的血液流動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè),可以為個(gè)體化方案的制定提供一定參考。對(duì)ACS患者進(jìn)行血運(yùn)重建可以改善反復(fù)發(fā)作的心肌缺血,延緩病情進(jìn)展。但是,術(shù)中的導(dǎo)引鋼絲通過(guò)、球囊擴(kuò)張及支架釋放等過(guò)程均可造成血管內(nèi)膜損傷,激活凝血系統(tǒng),誘發(fā)血液高凝狀態(tài);術(shù)后缺血再灌注損傷、靶血管直徑及殘余狹窄程度、支架擴(kuò)張不完全、支架術(shù)后殘余狹窄及殘余夾層皆可導(dǎo)致血栓形成。早期血栓以及血管內(nèi)膜平滑肌增生、血小板因子釋放等過(guò)程促進(jìn)了介入術(shù)后再狹窄的發(fā)生。再狹窄形成之后又進(jìn)一步影響了血液的正常流動(dòng),從而引起血小板活化、黏附、聚集,形成晚期支架內(nèi)血栓。

      目前,除纈沙坦預(yù)處理被認(rèn)為對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[10],并應(yīng)用于ACS介入術(shù)后患者之外,PCI后抗血小板治療不容忽視。阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷的雙重抗血小板治療被認(rèn)為是急性冠脈綜合征抗血小板治療的重要基礎(chǔ)[11]。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)2009年發(fā)布的經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療指南[12]顯示,如無(wú)高出血風(fēng)險(xiǎn),雙抗(阿司匹林100mg/d,氯吡格雷75mg/d)至少使用1年。EXCEL生物可降解涂層藥物洗脫支架多中心注冊(cè)研究(Multi-Center Registry of EXCEL BiodegrAdable Drug EluTing StEnt,CREATE)顯示,雙抗治療2077例置入生物可降解涂層EXCEL西羅莫司洗脫支架患者6個(gè)月與12個(gè)月的死亡率分別為0.9%和1.1%,非致死性心肌梗死的發(fā)生率為 0.3%和0.4%[13]。Park等[14]對(duì)晚期冠狀動(dòng)脈血栓事件相關(guān)性和晚期冠狀動(dòng)脈血栓事件評(píng)價(jià)2個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行的匯總分析表明,對(duì)于服用雙聯(lián)抗血小板藥物已達(dá)1年,且在此1年內(nèi)未發(fā)生任何心血管不良事件的患者,繼續(xù)服用雙聯(lián)抗血小板藥物不但不能降低支架內(nèi)血栓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),反而使心源性死亡、心肌梗死和卒中復(fù)合終點(diǎn)事件的風(fēng)險(xiǎn)呈增加趨勢(shì)(風(fēng)險(xiǎn)比為1.84,P<0.05)。

      由此可見(jiàn),現(xiàn)有臨床證據(jù)相互矛盾,各影響因素差異較大,個(gè)體化方案已成為ACS治療的發(fā)展趨勢(shì)。血小板P-選擇素是血小板激活后α顆粒釋放的標(biāo)準(zhǔn),是目前最具有特征性的血小板活化分子標(biāo)志物,它能直接反映血小板的活化程度;PDGF以α-顆粒的形式存在于血小板中,血小板通過(guò)釋放功能使PDGF參與上皮細(xì)胞增生修復(fù)、間質(zhì)細(xì)胞的增生和膠原沉積等過(guò)程,故血中PDGF的表達(dá)在一定程度上反映了血小板的釋放功能,本研究中的PDGF-BB為PDGF的一種亞型,其檢測(cè)意義與PDGF相同;當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí),vWF釋放入血,可促進(jìn)血小板黏附、聚集,并參與血栓形成,是反映內(nèi)皮細(xì)胞功能及損傷程度的指標(biāo),同時(shí)也可以作為反映動(dòng)脈血栓形成的危險(xiǎn)指標(biāo)。

      對(duì)于ACS介入術(shù)后支架內(nèi)血栓形成的患者,早期血栓形成的同時(shí),活化的血小板所釋放的P-selectin和PDGF可反過(guò)來(lái)加重血管內(nèi)膜損傷、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)中膜平滑肌細(xì)胞增殖和向內(nèi)膜下遷移[15],進(jìn)而影響血液的正常流動(dòng),引起血小板活化、黏附、聚集,或加之抗血小板治療不當(dāng),可促進(jìn)晚期支架內(nèi)血栓的形成;而且vWF以復(fù)合物的形式參與血栓形成,其水平是影響PCI術(shù)后1年主要心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P <0.01)[16]。在國(guó)內(nèi),首次應(yīng)用MC-FAN觀測(cè)ACS介入術(shù)后患者的血液流變情況。本研究測(cè)得健康人 100 μL血液的通過(guò)時(shí)間為(80.57±5.01)s,這與日本靜岡縣立大學(xué)那須惠子等[17]檢測(cè)的結(jié)果基本一致。ACS介入術(shù)后患者100 μL 血液的通過(guò)時(shí)間為(116.61 ±28.56)s,較健康人明顯延長(zhǎng)。而且在檢測(cè)過(guò)程中可以通過(guò)電腦顯示器清晰地看到:與健康人比較,ACS介入術(shù)后患者血液的紅細(xì)胞變形能力相對(duì)減弱,白細(xì)胞附壁及血小板的黏附、聚集相對(duì)增多。

      本研究測(cè)得ACS介入術(shù)后患者的可視化血液流變學(xué)異常,并且血小板最大聚集率、血小板黏附率、P-selectin和PDGF-BB結(jié)果皆較健康組升高,與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符[18]。本研究顯示:MC-FAN所測(cè)10 μL血液 MC-FAN TT 與 P-selectin、PDGF-BB、vWF、PAdT和PAgT的值存在相關(guān)性;30 μL血液MC-FAN TT與P-selectin、PDGF-BB和vWF的值存在相關(guān)性;60 μL血液 MC-FAN TT 與 PAgT、P-selectin 和 vWF的值存在相關(guān)性;100 μL血液MC-FAN TT與PAgT、PAdT的值存在相關(guān)性。這些結(jié)果表明,MC-FAN TT與血小板功能存在相關(guān)性。其中10 μL血液MCFAN TT和30 μL血液MC-FAN TT與P-selectin的相關(guān)性最顯著;60 μL血液MC-FAN TT與血小板最大聚集率的相關(guān)性最顯著;100 μL血液MC-FAN TT與血小板黏附率的相關(guān)性最顯著,這與血液離體后血小板活化、聚集和黏附的時(shí)相順序相一致。由此可見(jiàn),ACS介入術(shù)后患者的可視化血液流變學(xué)變化及血小板功能異常,MC-FAN是直觀反映血小板流變情況、客觀評(píng)價(jià)患者血液流動(dòng)狀態(tài)的儀器。我們可以通過(guò)對(duì)ACS介入術(shù)后患者的MC-FAN檢測(cè)結(jié)果,更清晰地了解患者血小板的活化程度,從而為臨床抗血小板個(gè)體化治療提供參考。同時(shí),我們通過(guò)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的分析,可以更有效預(yù)防術(shù)后晚期血栓的形成。

      [致謝:本課題儀器操作和圖像處理得到日本エムシー(MC-FAN)研究所市橋裕一、柳田敏男工程師和北京咸通佳儀科技發(fā)展有限公司咸大元、陳亦舟工程師的指導(dǎo)和幫助,謹(jǐn)致謝忱!]

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