范悅，吳曉光，趙泓翔，商亞珍

(河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

半枝蓮黃酮對Aβ25-35引起的大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞NOS、HSP70及apoE異常表達(dá)的影響*

范悅，吳曉光，趙泓翔，商亞珍△

(河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

目的:探討半枝蓮黃酮對Aβ25-35引起大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮合酶(NOS)熱休克蛋白70 (HSP70)及載脂蛋白E(apoE)蛋白表達(dá)異常變化的影響。方法：培養(yǎng)第3代的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、模型組和3個劑量藥物組，藥物組細(xì)胞分別加入17.5、35和70 mg/L半枝蓮黃酮作用24 h后，模型組和3個劑量藥物組均加入Aβ25-35100 μmol/L作用24 h，免疫組化法測定星形膠質(zhì)細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)蛋白的表達(dá);Western blotting檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞中HSP70蛋白的表達(dá);RT-PCR測定細(xì)胞中apoE mRNA的表達(dá)。結(jié)果:與空白組相比，模型組eNOS蛋白含量降低60.83%(P＜0.01)，iNOS蛋白含量增加215.03%(P＜0.01)，HSP70蛋白含量增加166.67%(P＜0.01)，apoE mRNA含量增加150.00%(P＜0.01);半枝蓮黃酮17.5、35及70 mg/L能不同程度地提高eNOS蛋白含量73.66%～137.77%(P＜0.05)，降低iNOS蛋白含量19.40%～44.50%(P＜0.01)，降低HSP70蛋白含量18.52%～49.38% (P＜0.01)，降低apoE mRNA的含量14.17%～41.67%(P＜0.01)。結(jié)論:半枝蓮黃酮對Aβ25-35引起的大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷具有抑制作用。半枝蓮黃酮可能通過影響星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮對阿爾茨海默病的治療作用。

阿爾茨海默病;星形細(xì)胞;半枝蓮黃酮;一氧化氮合酶;熱休克蛋白70;載脂蛋白E類

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是最常見的癡呆類型，臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知障礙和精神異常。AD的發(fā)病機(jī)制目前還不完全明確，但神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、膽堿能神經(jīng)功能紊亂、免疫異常和基因遺傳等因素［1］都與之密切相關(guān)。Aβ是39～43個氨基酸殘基組成的肽段，Aβ25-35是其中的主要毒性片段，對體外培養(yǎng)及在體的神經(jīng)細(xì)胞均有毒性［2］。

自一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)被發(fā)現(xiàn)以來，對它的研究日益深入。大量的研究發(fā)現(xiàn)，NO不僅是在正常情況下與學(xué)習(xí)、記憶相關(guān)的信號分子，在異常的情況下也參與AD的發(fā)生和進(jìn)展［3］。熱休克蛋白在細(xì)胞損傷修復(fù)方面有重要作用，目前對熱休克蛋白的研究也越來越得到研究人員的重視，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白70(heat-shock protein 70，HSP70)可以在早期階段抑制Aβ1-42的聚集［4］，抑制Aβ相關(guān)的毒性作用，故HSP70與AD的病理生理過程有密切聯(lián)系。載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)也廣泛參與了AD發(fā)病的各個方面，包括Aβ的沉積、tau蛋白的異常磷酸化、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)的形成、神經(jīng)變性以及精神和行為缺陷等［5］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞作為數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，與神經(jīng)退行性疾病關(guān)系極為密切。目前對膠質(zhì)細(xì)胞的影響隨著研究進(jìn)展則越來越受到重視，因此，干預(yù)星形膠質(zhì)細(xì)胞異常變化可能有利于神經(jīng)退行性疾病的治療。

半枝蓮黃酮(Scutellaria barbata flavonoids，SBF)是從半枝蓮地上部分提取、分離的黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化和改善記憶障礙等多種藥理學(xué)作用［6-8］。其神經(jīng)保護(hù)作用緣于其多羥基結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)還原性，但對膠質(zhì)細(xì)胞的影響未見報道，本研究利用Aβ25-35損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞體外模型，探討半枝蓮黃酮是否通過對星形膠質(zhì)細(xì)胞的NOS、HSP70 及apoE表達(dá)的影響發(fā)揮抗癡呆作用。

材料和方法

1 動物和藥品

新生1～3 d的SD大鼠(合格證為No.90912)，雌雄不限，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。半枝蓮黃酮承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提供。DMEM-F12培養(yǎng)基購于Gibco，胎牛血清購于PAA，胰蛋白酶購于華美生物工程有限公司。Aβ25-35購于上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，NOS、HSP70Ⅰ抗購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Ⅱ抗試劑盒、DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。ApoE(67 bp)上游引物5’-GCAGAGCTCCCAAGTCACACAG-3’，下游引物5’-TGCCTTTACTTCCGTCA-TAGTGTCC-3’;βactin(150 bp)上游引物5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，下游引物5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0(100次量)購于大連寶生物工程有限公司。

2 方法

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)新生1～3 d的SD大鼠，消毒，取出雙側(cè)大腦皮層，剔除腦膜及血管，剪碎，加入0.125%胰蛋白酶置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育消化30 min，含20%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。離心，以5×104cells/cm2的密度接種于用0.1%多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中。30 min后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出未貼壁的細(xì)胞懸液，重新接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)3 d換液1次，培養(yǎng)10 d左右細(xì)胞長滿瓶底進(jìn)行傳代。傳代第3代細(xì)胞利用免疫組化法對星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白——膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)進(jìn)行細(xì)胞鑒定，通過隨機(jī)選取若干視野，陽性細(xì)胞計數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)傳代第3代95%細(xì)胞為星形膠質(zhì)細(xì)胞［9］。

2.2 Aβ25-35和半枝蓮黃酮的配制將Aβ25-35溶于三蒸水中過濾除菌，再與培養(yǎng)液混合配成200 μmol/L貯備液，分裝-20℃保存，使用前需置37℃溫箱孵育7 d以形成有神經(jīng)毒性的聚集型Aβ25-35。半枝蓮黃酮溶于培養(yǎng)液中，配成100 mg/L貯備液，過濾除菌，分裝4℃保存。

2.3 Aβ25-35和半枝蓮黃酮的作用3代以上的細(xì)胞以5×104cells/well接種于24孔板內(nèi)的0.1%多聚賴氨酸包被的蓋玻片上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，分為空白對照組、模型組和半枝蓮3個劑量藥物組，3個劑量藥物組細(xì)胞加含17.5、35和70 mg/L半枝蓮黃酮的培養(yǎng)液，空白組和模型組細(xì)胞給予無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。隨后除空白組加無血清DMEM/F12培養(yǎng)液外，其余各組再加Aβ25-35使其終濃度為100 μmol/L，再培養(yǎng)24 h，進(jìn)行指標(biāo)的檢測。

2.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)蛋白含量的檢測半枝蓮黃酮和Aβ25-35分組處理后，分別將細(xì)胞進(jìn)行eNOS、iNOS和nNOS蛋白表達(dá)的常規(guī)免疫組化測定，I抗?jié)舛?∶100，DAB顯色，脫水，透明，中性樹膠封片。同時用PBS代替Ⅰ抗作陰性對照。

2.5 星形膠質(zhì)細(xì)胞中HSP70的檢測培養(yǎng)第3代的星形膠質(zhì)細(xì)胞5×104cells/cm2的密度接種至培養(yǎng)瓶中，貼壁48 h后半枝蓮黃酮和Aβ25-35處理后，常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，I抗為HSP70(1∶100)和β-actin(1∶500)，4℃孵育過夜，II抗(1∶3 000)孵育1 h，ECL發(fā)光液覆蓋3min后，暗匣曝光，顯影，定影。利用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以目的條帶吸光度與βactin條帶吸光度的比值作為HSP70蛋白表達(dá)的相對水平。

2.6 星形膠質(zhì)細(xì)胞中apoE的檢測采用RT-PCR法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞中的apoE的含量，培養(yǎng)至第3代的星形膠質(zhì)細(xì)胞以5×104cells/cm2的密度接種至6孔板中，48 h后用半枝蓮黃酮和Aβ25-35處理，抽提總RNA，用DU800紫外可見分光光度計測定RNA濃度和純度。TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠于紫外透射儀中確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物并攝取圖像。利用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以目的條帶吸光度值與β-actin條帶吸光度值的比值作為各目的基因mRNA表達(dá)的相對水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 SBF對星形膠質(zhì)細(xì)胞中NOS蛋白表達(dá)的影響

1.1 SBF對星形膠質(zhì)細(xì)胞中eNOS蛋白表達(dá)的影響與空白組相比，模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞中棕色顆粒數(shù)量明顯減少，顏色變淺，陽性細(xì)胞數(shù)量也明顯減少，通過陽性面積比例的統(tǒng)計學(xué)分析，模型組細(xì)胞eNOS含量降低60.83%(P＜0.01)。與模型組相比，半枝蓮黃酮3個劑量組能不同程度提高星形膠質(zhì)細(xì)胞中eNOS的蛋白含量，半枝蓮黃酮17.5、35及70 mg/L能分別提高eNOS含量73.66%、137.77% (P＜0.01)及81.67%(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Effect of SBF on eNOS expression in Aβ25-35-damaged astrocytes.A:control group;B:model group;C～E:SBF groups at doses of 17.5，35 and 70 mg/L，respectively(DAB staining，×200).Mean±SD.n=6.##P＜0.01 vs control;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model.圖1 SBF對Aβ25-35損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞中eNOS蛋白表達(dá)的影響

1.2 SBF對星形膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且細(xì)胞內(nèi)棕色顆粒數(shù)量明顯增加，顏色變深，通過陽性面積比例統(tǒng)計學(xué)分析，模型組細(xì)胞iNOS含量增加215.03%(P＜0.01)。與模型組相比，半枝蓮黃酮3個劑量組能不同程度降低星形膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS蛋白含量，半枝蓮黃酮17.5、35及70 mg/L能分別降低iNOS含量29.36%(P＜0.01)、44.50%(P＜0.01)及19.40%(P＜0.01)，見圖2。

1.3 SBF對星形膠質(zhì)細(xì)胞中nNOS蛋白表達(dá)的影響

通過nNOS免疫組化測定，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞胞核藍(lán)染，胞漿內(nèi)無陽性棕黃色顆粒，星形膠質(zhì)細(xì)胞中不表達(dá)nNOS。

2 SBF對星形膠質(zhì)細(xì)胞中HSP70蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)增加166.67%(P＜0.01)。與模型組相比，半枝蓮黃酮3個劑量組能不同程度減少星形膠質(zhì)細(xì)胞中的HSP70蛋白表達(dá)，半枝蓮黃酮17.5、35及70 mg/L能分別減少HSP70蛋白的表達(dá)18.52%(P＜0.01)、49.38%(P＜0.01)及33.95%(P＜0.01)，見圖3。

Figure 2.Effect of SBF on iNOS expression in Aβ25-35-damaged astrocytes.A:control group;B:model group;C～E:SBF groups at doses of 17.5，35 and 70 mg/L，respectively(DAB staining，×200).Mean±SD.n=6.##P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs model.圖2 SBF對Aβ25-35損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.Effect of SBF on HSP70 expression in Aβ25-35-damaged astrocytes.The expression of HSP70 was assayed by Western blotting.Mean±SD.n=6.##P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs model.圖3 SBF對Aβ25-35損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞中HSP70蛋白表達(dá)的影響

3 SBF對星形膠質(zhì)細(xì)胞中apoE表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組apoE mRNA含量增加150%(P＜0.01)。與模型組相比，半枝蓮黃酮3個劑量組能不同程度降低星形膠質(zhì)細(xì)胞中apoE mRNA的含量，其中半枝蓮黃酮17.5、35及70 mg/L能分別降低apoE mRNA含量14.17%(P＜0.01)、41.67%(P＜0.01)及37.50%(P＜0.01)，見圖4。

Figure 4.Effect of SBF on apoE expression in Aβ25-35-damaged astrocytes.The expression of apoE was determined by RT-PCR.Mean ±SD.n=6.##P＜0.01 vs control;＊＊P＜0.01 vs model.圖4 SBF對Aβ25-35損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞中apoE mRNA表達(dá)的影響

討論

AD的特征性病理改變是腦內(nèi)出現(xiàn)Aβ聚集而形成的老年斑(senile plaques，SPs)和tau蛋白過度磷酸化而產(chǎn)生的NFTs，同時伴隨以海馬、皮層區(qū)域?yàn)橹鞯纳窠?jīng)元的大量丟失。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量最多的一種，除了以往認(rèn)識的在神經(jīng)系統(tǒng)中有支持營養(yǎng)作用外，與神經(jīng)元之間還存在復(fù)雜的相互作用，也與許多神經(jīng)退行性疾病有密切相關(guān)。NO/NOS在AD病程中可能具有雙重作用，低濃度(＜100 nmol/L)NO激活鳥苷酸環(huán)化酶，可促進(jìn)神經(jīng)元內(nèi)cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化，經(jīng)復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)途徑，促進(jìn)神經(jīng)生長及抗凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。而高濃度(＞400 nmol/L)NO，可導(dǎo)致線粒體功能障礙、凋亡通路的激活等，從而介導(dǎo)神經(jīng)毒性［10］。NOS是NO合成最關(guān)鍵的限速酶，其含量及活性的變化直接影響NO的生成，大量研究通過NOS來探討其有關(guān)作用。目前已確定的NOS有3種亞型，分別是nNOS、iNOS和eNOS。nNOS主要存在于神經(jīng)元中，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不表達(dá)nNOS或表達(dá)很少。大量激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)在AD早期階段的未成熟老年斑周圍，同時，這些星形膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS的表達(dá)也增加，提示iNOS持續(xù)產(chǎn)生過量的NO在AD的發(fā)展過程中起到促進(jìn)作用［11］。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M星形膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS表達(dá)明顯增加，eNOS表達(dá)明顯減少，半枝蓮黃酮能不同程度改善NOS蛋白表達(dá)紊亂的現(xiàn)象，減少NO的神經(jīng)損傷。

HSP是細(xì)胞受到各種刺激時產(chǎn)生的具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質(zhì)分子家族，參與蛋白質(zhì)的合成、折疊、裝配、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解等過程，以維持細(xì)胞蛋白自穩(wěn)，提高細(xì)胞對應(yīng)激原的耐受性，并有助于細(xì)胞恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)和機(jī)能。HSP70是生物中含量最多、最重要的HSP家族之一，細(xì)胞應(yīng)激后生成最顯著［12］。有研究利用Aβ轉(zhuǎn)基因C.elegans線蟲模型，通過siRNA技術(shù)內(nèi)源性調(diào)節(jié)HSP70的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HSP70可以減少Aβ聚集，抑制Aβ的毒性作用［13］。同時，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了外源性HSP70能夠促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬和清除Aβ1-42，機(jī)制可能與外源性HSP70通過Toll樣受體4誘導(dǎo)NF-κB及激活p38 MAPK途徑有關(guān)，說明HSP70在促進(jìn)Aβ的清除中起到重要作用［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在Aβ的刺激損傷下星形膠質(zhì)細(xì)胞中HSP70蛋白表達(dá)明顯代償性增加，來抵御Aβ的神經(jīng)毒性損傷，以保護(hù)細(xì)胞。半枝蓮黃酮干預(yù)后，細(xì)胞得到一定程度的保護(hù)，HSP70蛋白的表達(dá)開始出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，間接說明了半枝蓮黃酮對于Aβ?lián)p傷星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定保護(hù)作用。

ApoE主要在肝臟和大腦中合成，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，而在周圍神經(jīng)系統(tǒng)是通過巨噬細(xì)胞合成。Aβ是老年斑的核心成分，其毒性作用使神經(jīng)突起變性，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時，星形膠質(zhì)細(xì)胞合成apoE增加，并向受損部位運(yùn)送增加，apoE與Aβ結(jié)合，形成apoEAβ復(fù)合物由中性粒細(xì)胞通過LRP介導(dǎo)清除［15］。ApoE-Aβ復(fù)合物是AD腦中淀粉樣沉淀的主要成分，在AD病人中，apoEε4純合個體表現(xiàn)出更大的細(xì)胞外淀粉樣斑塊和密度［16］。進(jìn)一步研究顯示，apoE在體外實(shí)驗(yàn)中可以促進(jìn)可溶性Aβ向淀粉樣纖維的β-折疊片層構(gòu)造的轉(zhuǎn)化，由此可以得到apoE參與Aβ聚合和老年斑形成的假說［17］。ApoE在神經(jīng)元損傷后的修復(fù)過程中起到重要作用，在對腦組織損傷的反應(yīng)中，apoE mRNA的水平升高，神經(jīng)元膽固醇合成降低，與細(xì)胞結(jié)合的脂蛋白增多［18］，這些改變都說明apoE通過重復(fù)利用受損細(xì)胞的膜成分進(jìn)而幫助細(xì)胞修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞apoE mRNA含量明顯增加，說明在Aβ?lián)p傷情況下，細(xì)胞合成apoE增加，半枝蓮黃酮能不同程度減少apoE mRNA，對于改善Aβ?lián)p傷星形膠質(zhì)細(xì)胞有明顯作用。

半枝蓮含有多種化學(xué)成分，以黃酮類化合物為主，其中以野黃芩苷含量最多，研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮及其提取成分具有抗腫瘤、抗衰老和抗氧化等功效［19］，但除了黃酮類成分，還含有生物堿、酚類和鞣質(zhì)等，本研究部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，某些被檢指標(biāo)中劑量作用出現(xiàn)降低，量效曲線呈倒U形，這一結(jié)果符合中藥藥效學(xué)常見的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)半枝蓮黃酮在一定濃度范圍內(nèi)對Aβ25-35引起的損傷具有保護(hù)作用;通過藥物對星形膠質(zhì)細(xì)胞的干預(yù)成為對AD治療的新靶點(diǎn)。

［1］馬永興，俞卓偉.現(xiàn)代癡呆學(xué)［M］.第1版.北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2007:295-302.

［2］張萌濤，錢亦華，楊杰，等.丹參酮ⅡA對谷氨酸聯(lián)合淀粉樣蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用［J］.中國老年學(xué)雜志，2009，29(19):2465-2468.

［3］吳曉強(qiáng)，王小姍.一氧化氮/一氧化氮合酶在阿爾茨海默病中的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2012，18(1):25-27.

［4］Evans JC，Wisen S，Gestwicki JE.Heat shock proteins 70 and 90 inhibit early stages of amyloid beta-(1-42)aggregation in vitro［J］.J Biol Chem，2006，281(44):33182-33191.

［5］劉英華，尹君，王丹玲，等.載脂蛋白E與阿爾茨海默病的關(guān)系［J］.生命的化學(xué)，2005，25(1):10-12.

［6］殷秀霞，張樹峰，郗玉玲，等.去卵巢大鼠腦內(nèi)凋亡基因蛋白表達(dá)及半枝蓮黃酮的干預(yù)作用［J］.中國新藥雜志，2010，19(14):1255-1259.

［7］郗玉玲，劉敏華，張曉峰，等.半枝蓮黃酮對去卵巢大鼠記憶障礙的改善作用［J］.中國老年學(xué)雜志，2011，31 (2):242-245.

［8］董永彩，董雅潔，龔玉芳，等.半枝蓮黃酮對去卵巢大鼠血脂水平的影響［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30 (15):1260-1263.

［9］范悅，顏勇，商亞珍.大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)方法建立及鑒定［J］.神經(jīng)藥理學(xué)報，2011，1 (6):22-27.

［10］Lüth HJ，Holzer M，G?rtner U，et al.Expression of endothelial and inducible NOS-isoforms is increased in Alzheimer＇s disease，in APP23 transgenic mice and after experimental brain lesion in rat:evidence for an induction by amyloid pathology［J］.Brain Res，2001，913(1):57-67.

［11］劉輝，陳俊拋，梁豐，等.NOS及NO在介導(dǎo)Aβ神經(jīng)毒性和阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的作用［J］.中國臨床康復(fù)，2003，7(19):2682-2683.

［12］鮑娟，楊期東.熱休克蛋白70在阿爾茨海默病中作用的研究進(jìn)展［J］.國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志，2008，35(3):264-267.

［13］Fonte V，Kapulkin V，Taft A，et al.Interaction of intracellular beta amyloid peptide with chaperone proteins［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(14):9439-9444.

［14］Kakimura J，Kitamura Y，Takata K，et al.Microglial activation and amyloid-beta clearance induced by exogenous heat-shock proteins［J］.FASEB J，2002，16(6):601-603.

［15］賈曉靜，賈少杰，張昱，等.雌激素、apoE與阿爾茨海默?。跩］.中國老年學(xué)雜志，2007，3(6):593-595.

［16］Schmechel DE，Saunders AM，Strittmatter WJ，et al.Increased amyloid beta-peptide deposition in cerebral cortex as a consequence of apolipoprotein E genotype in late-onset Alzheimer disease［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1993，90 (20):9649-9653.

［17］Castano EM，Prelli F，Wisniewski T，et al.Fibrillogenesis in Alzheimer＇s disease of amyloid beta peptides and apolipoprotein E［J］.Biochem J，1995，306(Pt 2):599-604.

［18］Morris JC.The challenge of characterizing normal brain aging in relation to Alzheimer＇s disease［J］.Neurobiol Aging，1997，18(4):388-389.

［19］董永彩，商亞珍.半枝蓮的藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，26(1):98-100.

Effects of Scutellaria barbata flavonoids on abnormal expression of NOS，HSP70 and apoE induced by Aβ25-35in rat astrocytes

FAN Yue，WU Xiao-guang，ZHAO Hong-xiang，SHANG Ya-zhen
(Hebei Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development，Institute of Traditional Chinese Medicine，Chengde Medical College，Chengde 067000，China.E-mail:shangyz1018@sina.com)

AIM:To study the effects of Scutellaria barbata flavonoids(SBF)on abnormal expression of nitric oxide synthase(NOS)，heat-shock protein 70(HSP70)and apolipoprotein E(apoE)induced by Aβ25-35in rat astrocytes.METHODS:The third generation of cultured rat astrocytes was divided into 5 groups.The cells in 3 drug treatment groups were given SBF at dose of 17.5 mg/L，35 mg/L and 70 mg/L for 24 h，and then the cells in model group and 3 doses of SBF groups were exposed to Aβ25-35at concentration of 100 μmol/L for 24 h.The expression of endothelial nitric oxide synthase(eNOS)，inducible nitric oxide synthase(iNOS)and neuronal nitric oxide synthase(nNOS)in the cultured cells was assayed by immunohistochemical method.The expression of HSP70 was estimated by Western blotting and the mRNA expression of apoE was assessed by RT-PCR.RESULTS:Compared with control group，the protein level of eNOS were significantly decreased and the protein level of iNOS increased(P＜0.01)in model group.The protein expression of HSP70 and mRNA expression of apoE were notably increased(P＜0.01)in model group.However，these disturbances were attenuated by SBF at dose of 17.5，35 and 70 mg/L(P＜0.01).CONCLUSION:SBF has an obvious protective effect on damaged astrocytes induced by Aβ25-35，suggesting that SBF may be helpful for the treatment of Alzheimer disease.

Alzheimer disease;Astrocytes;Scutellaria barbata flavonoids;Nitric oxide synthase;Heat-shock protein 70;Apolipoproteins E

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.031

1000-4718(2014)02-0359-06

2013-07-05

2013-12-04

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.C2009001007);河北省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(No.05027)

△通訊作者Tel:0314-2290616;E-mail:shangyz1018@sina.com