孫剛，薛睿聰，劉晨，董吁鋼

(中山大學1附屬第一醫(yī)院心血管醫(yī)學部，2衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點實驗室，廣東廣州 510080)

新生大鼠心肌成纖維細胞培養(yǎng)方法的比較*

孫剛，薛睿聰，劉晨，董吁鋼△

(中山大學1附屬第一醫(yī)院心血管醫(yī)學部，2衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點實驗室，廣東廣州 510080)

目的:建立并比較新生大鼠心肌成纖維細胞的培養(yǎng)方法。方法：分別通過膠原酶+胰酶消化法和胰酶消化法對新生大鼠心肌組織進行消化，利用貼壁時間差分離心肌細胞和心肌成纖維細胞，然后對收集的心肌成纖維細胞進行形態(tài)、純度及對藥物反應(yīng)方面的檢測。結(jié)果:在細胞形態(tài)和純度方面，2種方法收集的心肌成纖維細胞沒有明顯差異，但用膠原酶+胰酶消化法可以獲得更多數(shù)量的心肌細胞;在藥物反應(yīng)方面，采用胰酶消化法獲得的心肌成纖維細胞比膠原酶+胰酶消化法具有更強的增殖能力。結(jié)論:采用膠原酶+胰酶消化法和胰酶消化法可以獲得相同形態(tài)和純度的心肌成纖維細胞，但是采用胰酶消化法獲得的心肌成纖維細胞對藥物具有更強的增殖反應(yīng)能力。

心肌成纖維細胞;膠原酶;胰酶

心肌纖維化是各種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一，而心肌成纖維細胞在這一過程中發(fā)揮著極其重要的作用。心肌成纖維細胞占整個心臟體積的25%，但數(shù)目占整個心臟細胞總數(shù)的60%～70%［1］，它不僅提供了心肌細胞賴以生存的結(jié)構(gòu)支架，而且還賦予心肌組織某些生理和病理學上的特征，因此，對心肌成纖維細胞的研究也受到越來越多的重視［2-4］。本研究應(yīng)用血管緊張素II(angiotensinⅡ，AngⅡ)作為刺激因素［5-6］，對目前常用的2種心肌成纖維細胞的培養(yǎng)方法進行比較，為基礎(chǔ)實驗心肌成纖維細胞的培養(yǎng)和研究提供了一定的依據(jù)。

材料和方法

1 動物

出生1～2 d的SD乳鼠(清潔級，由中山大學實驗動物中心提供)。

2 試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和D-Hanks液購于HyClone;0.25%胰蛋白酶(含EDTA)和I型膠原酶購自Gibco;抗vimentin、抗von Willebrand factor、抗desmin和抗Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(collagen type I alpha 1 chain，Col1A1)抗體購自Santa Cruz Biotechnology;Ang II購自Anaspec;BCA Protein Assay Kit購于Pierce;Cell Counting Kit-8(CCK-8)購于Dojindo Molecular Technology;5-乙炔基-2＇-脫氧尿苷(5-ethynyl-2＇-deoxyuridine，EdU)試劑盒購自Ribobio;Trizol試劑盒購自Life Technologies。

3 主要方法

3.1 心肌成纖維細胞的培養(yǎng)取1～2 d的新生SD乳鼠，乙醇消毒后開胸擠出心臟，去除心底結(jié)締組織后將心室剪成大小約1 mm×1 mm×1 mm的小塊，以Simpson等［7］的方法為基礎(chǔ)加于改進，分別用膠原酶+胰酶消化法和胰酶消化法對心室組織團塊進行消化。對于膠原酶+胰酶法，將配制好的0.05%I型膠原酶加入心肌組織，置于37℃恒溫槽振蕩約2 h，取出后倒掉膠原酶，加入0.125%胰酶放入37℃水浴箱孵育5 min，清洗并適當吹散細胞，收集細胞至含血清的培養(yǎng)基中，反復2～3次，直至細胞團塊消失;離心(1 000 r/min)后收集細胞，加入含血清培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁90 min［8］;對于胰酶消化法，將0.25%胰酶加入心肌組織團塊中，37℃水浴箱振蕩約20 min，取出后吹散并收集細胞，放入培養(yǎng)箱中貼壁90 min;根據(jù)心肌細胞和心肌成纖維細胞貼壁時間的不同(心肌成纖維細胞貼壁快，較易附于皿底)，收集貼壁細胞并加入含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合后傳代用于實驗。

3.2 心肌成纖維細胞純度的鑒定我們采用免疫熒光技術(shù)對心肌成纖維細胞的純度進行鑒定。細胞爬片待其達到約80%融合后，進行4%多聚甲醛固定，0.25%Triton破膜及山羊血清封閉后，加入Ⅰ抗(抗vimentin、抗von Willebrand factor和抗desmin抗體)，4℃過夜封閉;避光條件下加入Ⅱ抗孵育，4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚(4＇，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染細胞核后置于熒光顯微鏡下觀察。

3.3 CCK-8檢測細胞的數(shù)目變化將細胞接種于96孔培養(yǎng)板，待其達到約80%融合時加入Ang II孵育24 h，后加入CCK-8工作液孵育3～4 h，置于450 nm波長下測細胞吸光度(A)。

3.4 EdU檢測細胞DNA的合成將細胞接種于24孔培養(yǎng)板，待其達到約80%融合后加入Ang II孵育24 h，將EdU工作液以50 μmol/L的濃度加入細胞中孵育3 h，沖洗后，對細胞進行固化、破膜和染色，避光條件下對DNA進行染色，最后置于熒光顯微鏡下進行觀察。

3.5 Real-time PCR采用Trizol法提取細胞的總RNA，分光光度法測定其濃度。雙鏈cDNA的合成采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄體系完成，總反應(yīng)體積為20 μL，其中RNA為1 μg(用無核酶水配成10 μL)，隨機引物為2 μL，5×M-MLV Buffer 4 μL，dNTP mixture(10 mmol/L)1 μL，ribonuclease inhibitor 0.5 μL，M-MLV 1.5 μL，RNase-free water 1 μL，擴增條件為:30℃10 min，42℃60 min，70℃15min，共30～35個循環(huán)。Real-timePCR通過SYBRGreenI體系在LightCycler?480 System儀器上進行，反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min，后95℃10 s，60℃10 s，72℃20 s，共45個循環(huán)。引物序列:Col1A1正義鏈5＇-GAGCCAGCAGATTGAGAACAT-3＇，反義鏈5＇-TACTCTCCGCTCTTCCAGTCA-3＇;GAPDH正義鏈5＇-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3＇，反義鏈5＇-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3＇。

3.6 Western blotting細胞蛋白濃度通過BCA Protein Assay Kit測定，實驗步驟按照Zhang等［9］報道的方法。等量的蛋白提取物加入SDS分離膠后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用Ⅰ抗對目的蛋白進行孵育過夜，加入Ⅱ抗后用增強型化學發(fā)光試劑進行曝光。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，差異采用多個樣本均數(shù)比較的ANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 心肌成纖維細胞形態(tài)學的觀察

對細胞進行形態(tài)學觀察，發(fā)現(xiàn)2種方法培養(yǎng)的心肌成纖維細胞在分離初期均呈圓形，懸浮于培養(yǎng)基中，90 min后大多已完成貼壁，細胞伸展成梭形，胞核明顯，零星分散生長;心肌成纖維細胞生長迅速，2～3 d即可達到80%～90%的融合，如圖1所示，2 d后2種方法培養(yǎng)的成纖維細胞均排列均勻，部分交叉重疊，細胞呈梭形或者多角形，可形成“編織狀”外觀，胞體較大，胞漿透明，胞核明顯，呈橢圓形，整個細胞具有明顯的折光性，無自發(fā)性搏動，這與其他學者培養(yǎng)的細胞形態(tài)相似［10］，所以2種方法得到的細胞在形態(tài)學上沒有明顯差異，都是典型的心肌成纖維細胞的形態(tài)。

Figure 1.The morphology of cardiac fibroblasts harvested with two culture methods(×100).A:cardiac fibroblasts harvested with collagenase+trypsin digestion;B: cardiac fibroblasts harvested with trypsin digestion.圖1 2種培養(yǎng)方法獲得的心肌成纖維細胞的形態(tài)

2 心肌成纖維細胞純度的鑒定

我們利用免疫熒光法對心肌成纖維細胞的純度進行檢測，視野中藍色部分為非特異細胞核分布情況，綠色部分為特異性抗體的顯色，如圖2所示，2種方法培養(yǎng)的細胞中，抗vimentin抗體表達陽性的細胞數(shù)占總細胞數(shù)目的95%以上，而內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞的標志性抗體(抗von Willebrand factor和抗desmin抗體)表達均為陰性，表明2種方法培養(yǎng)出的細胞純度無明顯差異，且都達到了95%以上。

Figure 2.The identification of cellular purity.A:anti-vimentin antibody;B:anti-desminantibody;C:anti-von Willebrand factor antibody.圖2 細胞純度的鑒定

3 心肌成纖維細胞增殖能力的檢測

Ang II是最常用的刺激可增殖細胞進行增殖生長的藥物之一［11］，在本實驗中，我們采用Ang II (10-6mol/L)對心肌成纖維細胞進行刺激，首先通過CCK-8增殖實驗和EdU合成實驗來分別檢測心肌成纖維細胞數(shù)目和DNA合成的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)條件下，2種方法獲得的細胞均能在2～3 d內(nèi)達到80%～90%的融合，藥物刺激后，用胰酶消化法獲得的心肌成纖維細胞其DNA合成能力明顯高于膠原酶+胰酶消化法獲得的細胞(圖3A)，并且在CCK-8增殖實驗中，胰酶法獲得的細胞其增殖能力也明顯高于膠原酶+胰酶法(圖3B)，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。如圖4所示，在基礎(chǔ)條件下，2種方法獲得的細胞表達Col1A1 mRNA和蛋白的能力基本相同，沒有明顯的差別，加入Ang II后，2種方法獲得的心肌成纖維細胞表達Col1A1 mRNA和蛋白的能力均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0，05);同時用胰酶法獲得的細胞Col1A1 mRNA和蛋白的表達水平均高于膠原酶+胰酶法，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

Figure 3.Ang II regulated the proliferation of cardiac fibroblasts.A:DNA synthesis tested by EdU incorporation assay;B:prolifertion tested by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs collagenase+trypsin digestion group.圖3 Ang II刺激心肌成纖維細胞后增殖能力的檢測

討論

細胞培養(yǎng)對于心臟細胞實驗的開展有著十分重要的作用，目前心肌細胞的培養(yǎng)已經(jīng)趨于成熟，但是心肌成纖維細胞的培養(yǎng)方法繁多，各有特點，根據(jù)實驗要求不同，對細胞的要求也有所不同，在本實驗中我們就目前存在的2種主要的心肌成纖維細胞的培養(yǎng)方法，分別從形態(tài)、純度及對藥物的反應(yīng)等幾個方面進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種方法培養(yǎng)的心肌成纖維細胞在形態(tài)和純度方面沒有明顯區(qū)別，但是在對藥物刺激后其細胞的增殖反應(yīng)有所差異。我們首先從細胞代謝和DNA合成2個方面進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠原酶+胰酶消化法培養(yǎng)的心肌成纖維細胞其增殖速度明顯低于胰酶消化法獲得的細胞。同時我們還對藥物刺激后細胞基因和蛋白的合成變化進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于膠原酶+胰酶消化法，胰酶消化法獲得的細胞其主要成分Col1A1 mRNA和蛋白合成也明顯增多，說明胰酶消化法獲得的細胞對藥物的增殖效應(yīng)，不論從分子水平還是細胞水平都明顯優(yōu)于膠原酶+胰酶消化組。在細胞培養(yǎng)實驗中，胰酶主要用于心臟組織間質(zhì)蛋白的消化，其作用強，對細胞膜的破壞性也較大，因此許多研究對于胰酶消化法培養(yǎng)細胞持否定態(tài)度，認為其對細胞的存活有負面影響;而膠原酶(主要是I型膠原酶)作用溫和，對細胞的損傷小，長時間消化對細胞的損傷不大，故大多數(shù)實驗室傾向于采用短時間胰酶+長時間膠原酶雙酶消化法對細胞進行培養(yǎng)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)采用膠原酶+胰酶法可以獲得更多的心肌細胞，但對貼壁心肌成纖維細胞的數(shù)目沒有明顯影響，而胰酶法雖然對心肌細胞的影響較大(心肌細胞成活率明顯降低)，但是該法獲得的心肌成纖維細胞對藥物刺激后具有更強的增殖能力;對于這一現(xiàn)象我們可以解釋為:第一，從細胞本身方面，心肌細胞活性明顯低于心肌成纖維細胞，對外界的環(huán)境要求頗高，故采用消化強度較低的膠原酶+胰酶法可以獲得更多的成活心肌細胞，而心肌成纖維細胞其活力較心肌細胞強，對環(huán)境要求偏低，故2種方法得到的原代心肌成纖維細胞從外形和純度上都沒有明顯區(qū)別;第二，采用胰酶法時其中的膠原酶主要是對細胞間質(zhì)的膠原纖維進行消化，在這一過程中，膠原酶是否也會對分泌膠原纖維的心肌成纖維細胞產(chǎn)生影響目前沒有相關(guān)的研究，但在我們的實驗中我們發(fā)現(xiàn)采用胰酶法獲得的心肌成纖維細胞其對藥物刺激后的增殖能力明顯優(yōu)于膠原酶+胰酶法獲得的細胞，故我們認為采用膠原蛋白酶消化心肌組織時也會對心肌成纖維細胞產(chǎn)生一定程度的影響。

綜上所述，在本研究中我們比較了目前較常用的2種培養(yǎng)心肌成纖維細胞的方法，從不同的角度對其特點進行了觀察，發(fā)現(xiàn)采用胰酶法獲得心肌細胞的效果不理想，但從某種程度上避免了膠原蛋白酶對心肌成纖維細胞的潛在損害，從而更好地保存了其自身的特點，為心肌纖維化研究中心肌成纖維細胞增殖模型的建立提供更好的方法依據(jù)。

Figure 4.The expression of Col1A1 mRNA and protein in cardiac fibroblasts harvested with the two methods.A: Col1A1 mRNA expression was determined by realtime PCR.The cells were treated with or without Ang II for 2 h.B:Col1A1 protein expression was determined by Western blotting.The cells were treated with or without Ang II for 24 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs collagenase+trypsin digestion group.圖4 2種方法培養(yǎng)的心肌成纖維細胞Col1A1 mRNA與蛋白的表達

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Comparison of two methods for culturing neonatal rat cardiac fibroblasts

SUN Gang，XUE Rui-cong，LIU Chen，DONG Yu-gang
(1Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital，2Key Laboratory of Assisted Circulation，Ministry of Health，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:dongxg@mail.sysu.edu.cn)

AIM:To establish and compare the methods for culturing neonatal rat cardiac fibroblasts culture.METHODS:Neonatal rat hearts were isolated by collagenase+trypsin or trypsin digestion.The cardiomyocytes and cardiac fibroblasts were isolated by different attachment techniques.The cellular morphology，purity and reactions to the reagent were tested.RESULTS:For morphology and purity，no difference between the 2 methods was observed，though more myocytes were harvested by the method of collagenase+trypsin digestion.For the cellular responses to reagent，the cardiac fibroblasts harvested with trypsin digestion had more potent proliferative ability than those with collagenase+trypsin digestion.CONCLUSION:There is no difference of cellular morphology and purity in the cardiac fibroblasts isolated by collagenase+trypsin digestion and trypsin digestion，but the fibroblasts with trypsin digestion have more potent proliferative ability.

Cardiac fibroblasts;Collagenase;Trypsin

Q253

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.035

1000-4718(2014)02-0380-05

2013-09-05

2013-11-06

廣東省自然科學基金資助項目(No.S2011040003614);廣東省科技計劃(No.B2011071)

△通訊作者Tel:020-87755766-8140;E-mail:dongxg@mail.sysu.edu.cn