牛麗靜, 白 云, 苗智慧, 管振龍, 夏曉紅, 王燕凌, 王惠娟
利鈉肽受體(natriuretic peptide receptors,NPRs)主要包括 NPR-A、NPR-B和 NPR-C,其中 NPR-A和NPR-B屬于具有鳥苷酸環(huán)化酶活性的受體,而NPRC通常被認為是可以從循環(huán)中清除利鈉肽的受體。利鈉肽通過激活細胞膜上的NPR-A或NPR-B參與對抗交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素系統(tǒng)的促進血管收縮、促有絲分裂的作用,并具有促進水鈉排泄的功能[1]。研究發(fā)現(xiàn),利鈉肽及其受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),特別在第三腦室區(qū)域、內側基底下丘腦[2-3]、腦干[4]及室周器官有密集的表達,其在中樞調控心血管穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用[5]。Sills等[6]向大鼠視交叉上核微量注射心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)后,引起血壓升高、心率加快;McKitrick等[7]在大鼠孤束核微量注射ANP,導致血壓降低,心率減慢。駱鴻等[8]將α-hANP直接應用于大鼠延髓腹外側吻端加壓區(qū),引起血壓下降、心率減慢。這些研究結果表明,利鈉肽參與了中樞心血管穩(wěn)態(tài)的調控,但具體機制不明。在病理條件下,尤其心肌缺血后利鈉肽受體在延髓心血管中樞按時程表達的變化,未見研究報道。本實驗擬以SD大鼠為實驗對象,復制急性心肌缺血動物模型,應用Western blotting技術檢測不同時點的NPR-A和NPR-C在腦干心血管調節(jié)相關區(qū)域的表達變化,以期找到其在心肌缺血后的時程變化規(guī)律,為探究中樞心血管調節(jié)區(qū)利鈉肽的作用機制及其在急性心肌缺血后中樞心血管調節(jié)中的可能作用提供基礎資料。
3月齡雄性Sprague-Dawley大鼠(體重280~330 g,河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供)60只,購入后于避強光、溫暖安靜的環(huán)境中飼養(yǎng)48 h。兔抗NPR-A多克隆抗體(Abcom)、兔抗NPR-C多克隆抗體(Abcom)、山羊抗膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase,ChAT)單克隆抗體(Millpore)和小鼠抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)單克隆抗體(Sigma)。
2.1 實驗分組及模型復制 大鼠隨機分為實驗組(模型組,43只)、假手術組(sham,8只)和空白對照組(control,9只)。實驗組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后,在第4~5肋骨間開胸,暴露心臟,用6號縫合線迅速結扎心臟的冠狀動脈左前降支復制心肌缺血動物模型。大鼠手術后進行恢復性飼養(yǎng)。將成活的模型組大鼠隨機分為3 d取材組(9只)、術后7 d取材組(7只)、術后14 d取材組(9只)、術后18 d取材組(9只)和術后28 d取材組(9只)。假手術組大鼠除了不結扎冠狀動脈左前降支外,其它手術與實驗組的處理相同。空白對照組大鼠不做手術處理,正常飼養(yǎng)。
2.2 取材 實驗組動物分別在手術后3 d(9只)、7 d(7只)、14 d(9只)、18 d(9只)和28 d(9只)深度麻醉(腹腔注射80 mg/kg戊巴比妥鈉),剪開胸腔,暴露心臟,經(jīng)升主動脈插管,先用100 mL生理鹽水沖洗血液。血液沖洗干凈后,迅速摘下心臟,用吸水紙吸干多余水分后稱重;打開顱骨取出腦組織,將腦組織置于冷的生理鹽水中,剝離大腦皮層及小腦,暴露腦干;由脊髓與延髓分界處至菱形窩中部為延髓,延髓腹側深約5 mm、前后約1.5 cm為延髓腹側部,并以最后區(qū)為界分為延髓腹側部吻段(約0.06 g)和延髓腹側部尾段(約0.035 g)。將取下的腦組織置于低溫環(huán)境(0~4℃)備用。實驗對照組大鼠、空白對照組大鼠于實驗組術后3 d按上述方法進行取材處理。
2.3 伊文思藍和TTC染色 從上述取材過程中取下的心臟的心尖部注入1 mL 3%伊文思藍。數(shù)秒后將心臟在4℃生理鹽水中沖洗,濾紙吸干水后-20℃保存30 min。隨后把冷凍后的心臟沿房室溝軸橫切成2.0~2.5 mm 厚的斷面,用0.1%的 TTC 生理鹽水溶液37℃孵育30 min。正常組織被染成藍色,缺血區(qū)未梗死心肌被染成紅色,梗死區(qū)不著色,以此判定心肌缺血模型是否復制成功[9-10]。
2.4 Western blotting分析 按解剖位置分區(qū)取材,分別將實驗組、實驗對照組以及空白對照組大鼠(n=3~4)處理并備用的組織混合,低溫下加入RIPA裂解液研磨成漿液,離心后取上清液,考馬斯亮藍蛋白定量。按照蛋白標準曲線測定組織上清液中的蛋白含量,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(每加樣孔中蛋白上樣量60 μg)之后,將凝膠進行轉膜,并進行NPR-A、NPR-C、ChAT和TH的印跡雜交(抗體稀釋濃度為1∶500)。以內參照β-actin條帶吸光度作為標準,計算NPR-A、NPR-C、ChAT和TH蛋白的相對表達量。
用ImageJ圖像分析軟件采集灰度值,并以SPSS 13.0數(shù)據(jù)處理軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差(mean±SD)表示,組間比較用單因素方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
活的心肌纖維里存在脫氫酶,TTC被其轉化成紅色的甲臜,而梗死區(qū)域的心肌纖維沒有脫氫酶,TTC會流失掉,心肌組織被染成蒼白色。被伊文思藍染色的組織是灌流充分未發(fā)生心肌缺血的組織,蒼白色的是心肌缺血后發(fā)生壞死的心肌組織。
模型動物心臟呈現(xiàn)深藍色,在冠脈結扎創(chuàng)口附近可見明顯的紅色缺血區(qū)和白色梗死區(qū);假手術組動物心肌可見少量紅色區(qū)域;空白對照組動物心臟未見紅色缺血區(qū)及白色梗死區(qū)域,見圖1。這提示所有大鼠心肌缺血模型復制成功。
Figure 2.Heart weight after coronary artery ligation.Mean±SD.n=6.**P <0.01 vs control;##P <0.01 vs sham.圖2 大鼠心臟在結扎手術后的平均重量
結扎大鼠心臟冠狀動脈左前降支復制大鼠心肌缺血模型后,隨時間的延長大鼠心臟明顯肥大,心臟重量也有升高的趨勢,并在術后14 d、18 d和28 d與空白對照組及假手術組相比均有極顯著的增加,見圖2。這些指標符合實驗預期的要求。
心肌梗死后大鼠延髓吻段Western blotting檢測結果如圖3所示。以β-actin(42 kD)作為內參照,NPR-A在相對分子量118 kD處有明顯的陽性條帶,NPR-C在相對分子量65 kD處有明顯的陽性條帶。心肌梗死后NPR-A的表達顯著升高,明顯高于空白對照組(P<0.01),梗死后3 d表達量約為空白對照組的3.5倍,隨后有逐漸下降的趨勢,到梗死后28 d蛋白表達量約為空白對照組的1.5倍。NPR-C的表達波動性較為明顯,心肌梗死后7 d開始逐漸升高,14和18 d顯著高于空白對照組(P<0.01),約為空白對照組蛋白表達量的1.5倍,而到28 d NPR-C的表達已經(jīng)恢復到了正常水平。
ChAT在相對分子量約68 kD處有明顯的陽性條帶,TH在相對分子量59 kD處有明顯陽性條帶。在心肌梗死后7 d,在延髓腹側部吻段的ChAT表達顯著低于空白對照組(P<0.01),隨后ChAT的表達有所升高,始終低于空白對照組,但無顯著差異。心肌梗死后,在延髓腹側部吻段的TH表達均顯著低于空白對照組(P<0.05),顯著差異,梗死后14 d和18 d表達最低(P<0.01),但波動性不顯著。
心肌梗死后大鼠延髓尾段Western blotting檢測結果如圖4所示。心肌梗死后3 d NPR-A的表達量顯著高于空白對照組(P<0.05),約為空白對照組蛋白表達量的1.4倍,之后隨時間推移有所波動,梗死后14 d蛋白表達量降至最低,不到空白對照組蛋白表達量的7/10,梗死后18 d,蛋白表達量高于空白對照組,但這些變化與對照組無顯著差異。心肌梗死后NPR-C的表達均有降低,28 d時與空白對照組比差異顯著,蛋白表達量不及對照組的3/10。心肌梗死后,ChAT和TH在延髓腹側部尾段的表達也有先降低后升高的趨勢,心肌梗死后3 d和7 d,TH的表達與空白對照組比有顯著差異(P<0.05)。
Figure 3.NPR-A,NPR-C,ChAT and TH expression in the rostral ventral medulla oblongata after coronary artery ligation.Mean±SD.n=6.*P <0.05,**P <0.01 vs control;#P <0.05,##P <0.01 vs sham.圖3 冠脈結扎后大鼠延髓腹側部吻段NPR-A、NPR-C、ChAT和TH的表達變化
大量的基礎和臨床實驗研究表明,心肌缺血后由于心肌收縮無力,心臟內積存的血液過多,對室壁壓力的增加誘導了利鈉肽大量的分泌,腦鈉肽的分泌量與心肌病變的程度呈正相關[11]。基礎實驗研究發(fā)現(xiàn),心肌梗死模型大鼠的血漿腦鈉肽濃度在第3天和第14天有2次升高[12],所以臨床上已將血液中腦鈉肽的變化作為評估冠心病的重要指標。血液中升高的利鈉肽一方面通過抑制腎上腺醛固酮的分泌,降低腎小管細胞的代謝活動,促進排鈉排水,降低血壓和回心血量,減少心臟內的血液積存;另一方面,血液內升高的利鈉肽可通過無血腦屏障的部位入腦,作用于不同中樞部位,通過影響激素的分泌和交感、副交感神經(jīng)的活動調節(jié)心血管的功能,以適應心肌缺血后的機能狀態(tài)。利鈉肽是通過細胞膜上的受體發(fā)揮作用的,所以血液中利鈉肽含量的升高必然影響其相應受體的表達及其功能。有研究證實,心肌缺血后的心肌組織內,心房肽和腦鈉肽的表達均顯著升高,NPR-C的表達也隨之增多,但于缺血后的第28 d在腎臟和肺內顯著降低[13],所以作者推測心肌缺血后,腦干心血管中樞區(qū)域的NPR-A、NPRC的表達可能也發(fā)生類似的適應性變化。
Figure 4.NPR-A,NPR-C,ChAT and TH expression in the caudal ventral medulla oblongata after coronary artery ligation.Mean±SD.n=6.*P <0.05,**P <0.01 vs control;#P <0.05,##P <0.01 vs sham.圖4 冠脈結扎后大鼠延髓腹側部尾段NPR-A、NPR-C、ChAT和TH的表達
本研究結果顯示,延髓腹側部吻段NPR-A的表達在缺血3 d后迅速升高,而后逐漸降低,但始終高于空白對照組,這與心肌缺血后血液中利鈉肽含量變化的時點和趨勢一致[12]。有實驗表明,向延髓腹側部吻段(升壓區(qū))微量注射心房肽能顯著降低心率和血壓[8]。所以,NPR-A表達的增加可提高利鈉肽對中樞的作用,可能通過對內臟神經(jīng)活動的調節(jié)保護受損的心肌。NPR-A在延髓腹側部尾段的表達與吻段相似,可能通過激活此處的神經(jīng)元來抑制升壓區(qū)的交感興奮,達到相似的效果。清除型的利鈉肽受體NPR-C的表達,在缺血后的第14 d和18 d達到峰值,顯著高于空白對照組(P<0.05)。其比血液中利鈉肽升高的時程稍晚,提示NPR-C表達增多與及時清除腦內過多的利鈉肽相關,這可能是在中樞內形成負反饋調節(jié)的機制之一。
本實驗對心肌缺血后ChAT和TH在延髓節(jié)段表達的檢測顯示,ChAT在延髓腹側部吻段、TH在延髓腹側部的表達均降低。以往的資料顯示,NPR-A與ChAT、NPR-A與TH均在延髓節(jié)段的神經(jīng)元上有共表達[14],NPR-C 也有相似的共表達模式[15]。心肌缺血后,NPR-A表達的升高與ChAT和TH表達的降低可能是影響交感、副交感神經(jīng)活動的途徑之一,但其具體的生理機制尚需進一步探討。
上述結果表明,心肌缺血后,延髓心血管調節(jié)中樞內神經(jīng)元的NPR-A和NPR-C表達顯著增加,而ChAT和TH的表達顯著降低。利鈉肽在延髓心血管中樞內與NPR-A結合,影響交感、副交感神經(jīng)的調節(jié),完成對受損心肌的保護作用。NPR-C的表達增加可能是機體對利鈉肽升高后的負反饋調節(jié)機制之一。至于ChAT和TH的表達變化是利鈉肽系統(tǒng)中樞心血管調控的上游因素還是結果有待進一步研究。本研究結果為進一步研究心肌缺血后利鈉肽的中樞調控機制提供了基礎資料。
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