葛春洋+馬宏佳
摘要:介紹了2014年諾貝爾化學(xué)獎獲獎成果超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和發(fā)現(xiàn)過程、獲獎?wù)吆啗r以及超分辨率熒光顯微技術(shù)的應(yīng)用前景。
關(guān)鍵詞:諾貝爾化學(xué)獎;超分辨率熒光顯微鏡;受激發(fā)射損耗顯微鏡;光激活定位顯微鏡
文章編號:1008-0546(2014)11-0002-03 中圖分類號:G633.8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B
doi:10.3969/j.issn.1008-0546.2014.11.001
北京時(shí)間2014年10月8日,瑞典皇家科學(xué)院宣布,將2014年諾貝爾化學(xué)獎授予美國科學(xué)家埃里克·貝齊格(Eric Betzig)、威廉姆·莫納(William Esco Moerner)和德國科學(xué)家斯特凡·赫爾(Stefan W. Hell),以表彰他們?yōu)榘l(fā)展超分辨率熒光顯微鏡所做的貢獻(xiàn)。
一、光學(xué)顯微鏡分辨率極限的存在
長期以來,光學(xué)顯微鏡的分辨率被認(rèn)為不會超過光波波長的一半,這被稱為“阿貝衍射極限”。1873年,德國科學(xué)家阿貝(E.Abbe)揭示了遠(yuǎn)場光學(xué)顯微鏡分辨率由于光的衍射效應(yīng)和有限孔徑分辨率極限而存在極限。這是由于可見光具有波動性,其可以發(fā)生衍射,因此光束不能無限聚焦。他的結(jié)論源于光學(xué)顯微鏡的分辨率的計(jì)算公式:
其中λ為光波波長,α為鏡口角的一半,n為傳播介質(zhì)的折射系數(shù)。空氣中n為1,α最大可為70度,此時(shí),sinα約為0.94,根據(jù)波長最短的藍(lán)光計(jì)算,λ≈450nm,則分辨率最小約為200nm。即阿貝分辨率極限的數(shù)值約為200nm。
1896年,英國物理學(xué)家瑞利(Rayleigh)提出,在成像光學(xué)系統(tǒng)中,分辨率是衡量分開相鄰兩個物點(diǎn)的像的能力。由于衍射,系統(tǒng)所成的像不再是理想的幾何點(diǎn)像,而是一定大小的光斑(愛里斑),當(dāng)兩個物點(diǎn)過于靠近,其像斑重疊在一起,就可能分辨不出是兩個物點(diǎn)的像,即光學(xué)系統(tǒng)中存在著一個分辨極限,這個分辨極限通常采用瑞利提出的判據(jù):當(dāng)一個愛里斑的中心與另一個愛里斑的第一級暗環(huán)重合時(shí),剛好能分辨出是兩個像,他歸納出一個常用分辨率公式:
Δmin=(λ為光波波長,α為鏡口角的一半,n為傳播介質(zhì)的折射系數(shù)。)
這從另一個角度印證了“阿貝衍射極限”理論。因此,人們認(rèn)為光學(xué)顯微鏡的成像效果受到光的波長限制,最大分辨率為光波的1/2。
二、光學(xué)顯微鏡分辨率極限的突破
科學(xué)發(fā)展的進(jìn)程激發(fā)人們對更小物質(zhì)的研究渴望,因此科學(xué)家們一直致力于超分辨率顯微鏡的研究。2014年諾貝爾化學(xué)獎的三位得主以創(chuàng)新手段“繞過”(突破)了這一極限,使光學(xué)顯微鏡的分辨率從微米級提高到納米級,他們的發(fā)現(xiàn)使顯微鏡進(jìn)入納米顯微鏡時(shí)代。
(1)斯特凡·赫爾的貢獻(xiàn)
2014年諾貝爾化學(xué)獎得獎的原理主要為兩項(xiàng),其一為斯特凡·赫爾研發(fā)的受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)(stimulated emission depletion,STED)。所謂的受激發(fā)射損耗(STED),指的是用一束激發(fā)光使熒光物質(zhì)發(fā)光的同時(shí),用另外的高能量脈沖激光器發(fā)射一束環(huán)型的波長較長的激光,將第一束光斑中大部分的熒光物質(zhì)通過受激發(fā)射損耗過程淬滅至基態(tài),并通過限制受激發(fā)射抑制的區(qū)域,獲得小于衍射極限的發(fā)光點(diǎn),從而顯著地提高了顯微鏡的分辨率。2000年,赫爾使用STED顯微鏡首次得到了大腸桿菌的圖像。
(2)埃里克·貝齊格和威廉姆·莫納的貢獻(xiàn)
第二項(xiàng)原理由埃里克·貝齊格和威廉姆·莫納研究,即單分子顯微鏡的原理。該原理的核心為激活和淬滅單個熒光分子。他們通過每次分辨少數(shù)分散的分子,多次沉積這些圖像得到一個納米級的高密度的超級圖像。
在莫納之前,人們觀測熒光分子時(shí)都是同時(shí)觀測到幾百萬幾千萬個分子,得到的結(jié)果是其平均統(tǒng)計(jì)結(jié)果。而莫納是第一個能夠探測單個熒光分子的人,他于1989年觀測到單個熒光分子。能夠探測并觀察單個熒光分子對于超分辨率顯微鏡極其重要。雖然單個熒光分子成像后也是一個0.2微米的光斑,但是在沒有其他分子存在的情況下,它的中心位置可以更精確地被確定下來的。
1997年莫納發(fā)現(xiàn)變異的綠色熒光蛋白可以隨意打開和關(guān)閉,當(dāng)他用波長488nm的光線去激發(fā)某種蛋白質(zhì)時(shí),它開始發(fā)出熒光,但一會熒光就消失了。此后不管他再使用任何光線去照射它,這個蛋白質(zhì)都無法再發(fā)出熒光。但是,當(dāng)他用波長為405nm的光線去照射它的時(shí)候,蛋白質(zhì)又再次復(fù)活并發(fā)出熒光。莫納將這些可以被激發(fā)的蛋白質(zhì)融入溶膠,使其均勻分布在其中,這使得單個分子之間的距離就能大于阿貝衍射極限。由于這些分子被分散開來,一臺常規(guī)的光學(xué)顯微鏡便可以區(qū)分來自單個分子發(fā)出的熒光——它們就像是帶著開關(guān)的小燈泡。
貝齊格發(fā)明的光激活定位顯微鏡(photoactivated localization microscopy,PALM),其中所利用的就是莫納發(fā)現(xiàn)的光激活方法。貝齊格利用微量的405nm激光照射細(xì)胞表面,使得其中極小部分熒光分子發(fā)出熒光。然后用488nm 激光照射,通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子,確定這些分子的位置。再依次用405nm和488nm的激光照射,以激活另一小部分熒光分子。重復(fù)這個過程即可將樣品中的所有分子定位出來,將這些分子的圖像合成到一張圖上,最后得到了比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高10倍以上分辨率的整個樣品的圖像。
值得一提的是,華裔科學(xué)家莊小威與貝齊格的工作在物理原理上完全一樣。莊小威課題組獨(dú)立發(fā)明的STORM技術(shù)使用激光“點(diǎn)亮”或“熄滅”細(xì)胞中的熒光,然后拍照。每次只“點(diǎn)亮”或“熄滅”細(xì)胞中一個位置。像逐行掃描一樣,一點(diǎn)點(diǎn)記錄細(xì)胞的圖像,最后通過多幅圖像疊合,得到完整、高分辨率圖像。莊小威發(fā)表的論文顯示,分辨率可以達(dá)到20納米。兩者的細(xì)微不同之處在于激發(fā)熒光材料的使用上,貝齊格用的是光敏蛋白,而莊小威用的是熒光染料。莊小威的相關(guān)論文于2006年8月9日發(fā)表在《自然·方法》期刊,而貝齊格的論文于次日(8月10日)發(fā)表在《科學(xué)》期刊,不過貝齊格的論文投出時(shí)間為2006年3月,比莊小威要早4個月。但貝齊格早在1995年就發(fā)表了理論設(shè)計(jì)論文。諾貝爾獎授予者解釋說這是莊小威憾失諾貝爾獎的原因。但她在超分辨率顯微鏡領(lǐng)域做出的貢獻(xiàn)仍不可否認(rèn)。
三、獲獎成果應(yīng)用前景
科學(xué)家們的成果將顯微技術(shù)帶入“納米”領(lǐng)域,讓人類能夠“實(shí)時(shí)”觀察活細(xì)胞內(nèi)的分子運(yùn)動規(guī)律,為疾病研究和藥物研發(fā)帶來革命性變化。利用超高分辨率顯微鏡,可以讓科學(xué)家們在分子水平上對活體細(xì)胞進(jìn)行研究,如觀察活細(xì)胞內(nèi)生物大分子、細(xì)胞器微小結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞功能如何在分子水平表達(dá)及編碼,對于理解生命過程和疾病發(fā)生機(jī)理具有重要意義。比如:在帕金森氏癥、阿爾茲海默氏癥(老年癡呆癥)或亨廷頓氏癥發(fā)作時(shí),科學(xué)家們可以跟蹤與之有關(guān)的蛋白質(zhì)的變化;受精卵分裂并發(fā)育成胚胎的過程中,也可以觀察這些單個蛋白質(zhì)的變化。正如諾貝爾化學(xué)獎評審委員會所說,三位科學(xué)家的研究成果為微生物研究帶來了幾乎無限的可能,“理論上講,如今沒有什么物質(zhì)結(jié)構(gòu)小得無法研究?!?/p>
四、獲獎?wù)吆喗?/p>
斯特凡·赫爾
1962年生于羅馬尼亞阿拉德。德國物理學(xué)家,馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所所長。1990年獲得海德堡大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1997年,在馬克斯·普朗克學(xué)會在哥廷根的生物物理化學(xué)研究所任研究員。2003年至今,赫爾是位于海德堡的德國癌癥研究中心高分辨率光學(xué)顯微技術(shù)部門的主任。
威廉姆·莫納
1953年生于美國加利福尼亞州的普萊森頓?;瘜W(xué)家,單分子光譜和熒光光譜領(lǐng)域的著名專家。畢業(yè)于圣路易斯華盛頓大學(xué)。1982年,獲得康奈爾大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1998年至今,在斯坦福大學(xué)擔(dān)任教授。
埃里克·貝齊格
1960年生于美國密歇根州安娜堡。美國神經(jīng)科學(xué)家、發(fā)明家、應(yīng)用物理學(xué)家?;羧A德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究帶頭人。他畢業(yè)于加州理工學(xué)院的物理學(xué)系,1988年獲得美國康奈爾大學(xué)博士學(xué)位。后在貝爾實(shí)驗(yàn)室工作。
參考文獻(xiàn)
[1] M?覽ns Ehrenberg .Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2014. The Royal Swedish Academy of Sciences,2014,10
[2] M?覽ns Ehrenberg,Sven Lidin. The Nobel Prize in Chemistry 2014.The Royal Swedish Academy of Sciences,2014,10
[3] 毛崢樂,王琛,程亞等. 超分辨遠(yuǎn)場生物熒光成像——突破光學(xué)衍射極限[J]. 中國激光,2008,35(9):1283-1307
[4] 呂志堅(jiān),陸敬澤,吳雅瓊等. 幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2009,36(12):1626-1634
[5] 楊鵬,艾華. 受激發(fā)射損耗顯微術(shù)及擴(kuò)展技術(shù)[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展,2011,(5):32-40
[6] http://www.guokr.com/article/439295/
[7] http://tieba.baidu.com/p/3339514957/
[8] http://money.163.com/14/1009/04/A83D1HLM00253B0
H.html
三、獲獎成果應(yīng)用前景
科學(xué)家們的成果將顯微技術(shù)帶入“納米”領(lǐng)域,讓人類能夠“實(shí)時(shí)”觀察活細(xì)胞內(nèi)的分子運(yùn)動規(guī)律,為疾病研究和藥物研發(fā)帶來革命性變化。利用超高分辨率顯微鏡,可以讓科學(xué)家們在分子水平上對活體細(xì)胞進(jìn)行研究,如觀察活細(xì)胞內(nèi)生物大分子、細(xì)胞器微小結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞功能如何在分子水平表達(dá)及編碼,對于理解生命過程和疾病發(fā)生機(jī)理具有重要意義。比如:在帕金森氏癥、阿爾茲海默氏癥(老年癡呆癥)或亨廷頓氏癥發(fā)作時(shí),科學(xué)家們可以跟蹤與之有關(guān)的蛋白質(zhì)的變化;受精卵分裂并發(fā)育成胚胎的過程中,也可以觀察這些單個蛋白質(zhì)的變化。正如諾貝爾化學(xué)獎評審委員會所說,三位科學(xué)家的研究成果為微生物研究帶來了幾乎無限的可能,“理論上講,如今沒有什么物質(zhì)結(jié)構(gòu)小得無法研究。”
四、獲獎?wù)吆喗?/p>
斯特凡·赫爾
1962年生于羅馬尼亞阿拉德。德國物理學(xué)家,馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所所長。1990年獲得海德堡大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1997年,在馬克斯·普朗克學(xué)會在哥廷根的生物物理化學(xué)研究所任研究員。2003年至今,赫爾是位于海德堡的德國癌癥研究中心高分辨率光學(xué)顯微技術(shù)部門的主任。
威廉姆·莫納
1953年生于美國加利福尼亞州的普萊森頓?;瘜W(xué)家,單分子光譜和熒光光譜領(lǐng)域的著名專家。畢業(yè)于圣路易斯華盛頓大學(xué)。1982年,獲得康奈爾大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1998年至今,在斯坦福大學(xué)擔(dān)任教授。
埃里克·貝齊格
1960年生于美國密歇根州安娜堡。美國神經(jīng)科學(xué)家、發(fā)明家、應(yīng)用物理學(xué)家。霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究帶頭人。他畢業(yè)于加州理工學(xué)院的物理學(xué)系,1988年獲得美國康奈爾大學(xué)博士學(xué)位。后在貝爾實(shí)驗(yàn)室工作。
參考文獻(xiàn)
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[5] 楊鵬,艾華. 受激發(fā)射損耗顯微術(shù)及擴(kuò)展技術(shù)[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展,2011,(5):32-40
[6] http://www.guokr.com/article/439295/
[7] http://tieba.baidu.com/p/3339514957/
[8] http://money.163.com/14/1009/04/A83D1HLM00253B0
H.html
三、獲獎成果應(yīng)用前景
科學(xué)家們的成果將顯微技術(shù)帶入“納米”領(lǐng)域,讓人類能夠“實(shí)時(shí)”觀察活細(xì)胞內(nèi)的分子運(yùn)動規(guī)律,為疾病研究和藥物研發(fā)帶來革命性變化。利用超高分辨率顯微鏡,可以讓科學(xué)家們在分子水平上對活體細(xì)胞進(jìn)行研究,如觀察活細(xì)胞內(nèi)生物大分子、細(xì)胞器微小結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞功能如何在分子水平表達(dá)及編碼,對于理解生命過程和疾病發(fā)生機(jī)理具有重要意義。比如:在帕金森氏癥、阿爾茲海默氏癥(老年癡呆癥)或亨廷頓氏癥發(fā)作時(shí),科學(xué)家們可以跟蹤與之有關(guān)的蛋白質(zhì)的變化;受精卵分裂并發(fā)育成胚胎的過程中,也可以觀察這些單個蛋白質(zhì)的變化。正如諾貝爾化學(xué)獎評審委員會所說,三位科學(xué)家的研究成果為微生物研究帶來了幾乎無限的可能,“理論上講,如今沒有什么物質(zhì)結(jié)構(gòu)小得無法研究?!?/p>
四、獲獎?wù)吆喗?/p>
斯特凡·赫爾
1962年生于羅馬尼亞阿拉德。德國物理學(xué)家,馬克斯·普朗克生物物理化學(xué)研究所所長。1990年獲得海德堡大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1997年,在馬克斯·普朗克學(xué)會在哥廷根的生物物理化學(xué)研究所任研究員。2003年至今,赫爾是位于海德堡的德國癌癥研究中心高分辨率光學(xué)顯微技術(shù)部門的主任。
威廉姆·莫納
1953年生于美國加利福尼亞州的普萊森頓?;瘜W(xué)家,單分子光譜和熒光光譜領(lǐng)域的著名專家。畢業(yè)于圣路易斯華盛頓大學(xué)。1982年,獲得康奈爾大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位。1998年至今,在斯坦福大學(xué)擔(dān)任教授。
埃里克·貝齊格
1960年生于美國密歇根州安娜堡。美國神經(jīng)科學(xué)家、發(fā)明家、應(yīng)用物理學(xué)家。霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究帶頭人。他畢業(yè)于加州理工學(xué)院的物理學(xué)系,1988年獲得美國康奈爾大學(xué)博士學(xué)位。后在貝爾實(shí)驗(yàn)室工作。
參考文獻(xiàn)
[1] M?覽ns Ehrenberg .Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2014. The Royal Swedish Academy of Sciences,2014,10
[2] M?覽ns Ehrenberg,Sven Lidin. The Nobel Prize in Chemistry 2014.The Royal Swedish Academy of Sciences,2014,10
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[4] 呂志堅(jiān),陸敬澤,吳雅瓊等. 幾種超分辨率熒光顯微技術(shù)的原理和近期進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2009,36(12):1626-1634
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[6] http://www.guokr.com/article/439295/
[7] http://tieba.baidu.com/p/3339514957/
[8] http://money.163.com/14/1009/04/A83D1HLM00253B0
H.html