宋彥顯，閔玉濤

(中州大學(xué)化工食品學(xué)院，鄭州450044)

中藥蒺藜，別名刺蒺藜、硬蒺藜、白蒺藜，有活血祛風(fēng)、平肝解郁、明目、止癢等功效。［1，2］蒺藜的主要生理活性成分為皂甙，有明顯的強壯及抗動脈硬化作用。蘇聯(lián)及保加利亞用其總皂甙制劑治療動脈硬化及提高性功能;我國用其全草開發(fā)了相應(yīng)制劑“心腦舒通”，在防治心腦血管疾病與性功能減退癥方面顯示良好療效。［3，4］鑒于蒺藜皂甙在健身、抗疲勞方面的突出作用，它有望成為功能因子研究領(lǐng)域中的一顆新星。本實驗在前人工作的基礎(chǔ)上對蒺藜皂甙的提取、分離、部分純化的工藝條件進行了系統(tǒng)研究，以期為醫(yī)藥和食品工業(yè)中新型功能因子的研究與開發(fā)提供可靠的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

蒺藜，購于鄭州中藥城，經(jīng)專職藥劑師鑒定;LSA-20大孔樹脂，西安電力樹脂廠。

SP-2102PC型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;HH-S11-2型電熱恒溫水浴鍋，北京長安科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒺藜皂甙的提取及分離

1.2.1.1 水提醇沉法

取粉碎至40目的蒺藜40g，加蒸餾水(固液比1∶10，W/V)回流提取3h，趁熱過濾，真空濃縮，以蒸餾水定容至 50mL，攪拌下緩慢加入95%乙醇425ml，濾去沉淀，真空濃縮至近干，硅藻土轉(zhuǎn)移，濾紙包裹，依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯索氏提取1h，再用正丁醇索氏提取3h。各提取組分分別濃縮，風(fēng)干，稱重，計算各部分收率。做定性試驗。

1.2.1.2 70%乙醇回流提取法

取粉碎至40目的蒺藜40g，70%乙醇(固液比1∶10，W/V)回流提取3h，趁熱抽濾，濾液真空濃縮至近干，浸膏硅藻土轉(zhuǎn)移，濾紙包裹，依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯索氏提取1h，再用正丁醇索氏提取3h，各提取組分分別濃縮，風(fēng)干，稱重，計算各部分收率。做定性試驗。

1.2.2 大孔吸附樹脂部分純化

將未使用過的大孔樹脂用乙醇浸泡一天活化，裝柱(柱內(nèi)徑2.6cm)，填料高度 18.1cm。用1%的NaOH約兩個床體洗滌，然后用1%的HCl洗滌。蒸餾水沖洗至中性，待用。

洗脫所用水及乙醇液體積可按床體的倍數(shù)添加，便于計算所需洗脫液體積。

正丁醇相濃縮至干，少量水溶，上柱，依次用蒸餾水和 20%，30%，40%，50%，55%，60%，65%，75%，80%，95%乙醇梯度洗脫，收集各組分，進行泡沫實驗和顏色反應(yīng)。將 40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脫液烘干稱重。

1.3 產(chǎn)物表征［5］

1.3.1 定性實驗

1.3.1.1 泡沫實驗

取樣品水溶液2mL于小試管中，用力振搖1min，如產(chǎn)生多量泡沫，放置15min后泡沫減少不明顯，則證明含皂甙。另各取樣液1mL，一管加2mL 0.1MNaOH 溶液，另一管加2mL 0.1MHCl溶液，用力振搖1min，泡沫高度相近是三萜皂甙，加堿管明顯高于加酸管的是甾體皂甙。

1.3.1.2 顯色反應(yīng)

(1)醋酐-濃硫酸反應(yīng)

取少量皂甙樣品溶解于醋酐中，加入醋酐-濃硫酸試劑，能產(chǎn)生顏色變化，一般由黃色轉(zhuǎn)為紅色、紫色、藍色或綠色。如果是甾體皂甙，在顏色的變化中最后呈現(xiàn)綠色，而三萜皂甙只能轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色、紫色或藍色，不出現(xiàn)綠色。

(2)三氯乙酸反應(yīng)

甾體皂甙滴在紙上，滴三氯乙酸試劑，加熱至60℃，生成紅色漸變?yōu)樽仙?。同樣情況下，三萜皂甙必須加熱到100℃才顯色，也生成紅色漸轉(zhuǎn)為紫色。

(3)氯仿-濃硫酸反應(yīng)

少量皂甙樣品溶解于氯仿，加入濃硫酸后，在氯仿層呈現(xiàn)紅色或藍色，硫酸層有綠色熒光出現(xiàn)。

(4)冰醋酸-乙酰氯反應(yīng)

少量皂甙樣品溶解于冰醋酸中，加入乙酰氯數(shù)滴及氯化鋅結(jié)晶數(shù)粒，稍加熱，則呈現(xiàn)淡紅色或紫紅色。

(5)三氯化銻反應(yīng)

樣品醇溶液點于濾紙上，噴20%三氯化銻氯仿溶液(不含乙醇或水)，于60～70℃加熱，樣品斑點呈灰藍﹑藍﹑灰紫等顏色。

1.3.1.3 其它物質(zhì)定性檢驗

(1)黃酮定性實驗(鹽酸-鎂粉反應(yīng))

樣品溶解于甲醇或乙醇，加入少量鎂粉振搖，滴加幾滴濃鹽酸，1～2min內(nèi)(必要時微熱)即可出現(xiàn)顏色。多數(shù)顯紅色～紫紅色，少數(shù)顯紫色～藍色。

(2)鞣質(zhì)定性實驗(三氯化鐵反應(yīng))

樣品液中滴入三氯化鐵溶液，縮合鞣質(zhì)呈綠色或綠黑色或沉淀，可水解鞣質(zhì)呈藍色或藍黑色并多有沉淀。

(3)糖類檢測(α-萘酚反應(yīng))

取樣液約1mL，加入α-萘酚試劑3滴，混勻，沿管壁慢慢加入濃硫酸約1mL，小心豎起試管，使硫酸與樣液清楚地分為兩層。兩液面間有紫色環(huán)，說明樣液中含糖。

1.3.2 薄層層析

以硅膠制成的分析板為固定相，以展開劑作為展開體系進行薄層層析。用毛細管取樣液點樣，點樣原點距底邊約0.8cm，原點線距展開前沿線約為6cm。在原點線上確定兩個點為點樣位置，邊點樣邊用吹風(fēng)機吹溶劑，防止樣點擴散。吹干后將硅膠板置于已加入展開劑的層析缸中展開，待展開至前沿線取出，再次吹干后放入碘盒中碘熏顯色，約2 min后取出，觀察分離情況。

1.3.3 紫外可見分光光度法

1.3.3.1 比色

0.0045g皂甙溶于40mL 80%甲醇液中(樣品濃度為0.112mg/mL)，分別移取 0mL，0.4mL，0.8mL，1.2mL，1.6mL，2.0mL 于試管中，各加 2.0mL 0.5%香草醛乙醇溶液、1.0mL72%硫酸溶液，加80%甲醇至6mL，波長544nm處測吸光度。

1.3.3.2 紫外掃描

(1)大孔樹脂分離純化的蒺藜皂甙用無水乙醇溶，分別取 50μL，60μL，70μL，80μL，90μL 在 200 ～360nm范圍內(nèi)進行掃描，以乙醇做空白。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒺藜皂甙的提取與初步分離研究

2.1.1 皂甙粗提方法的選擇

蒺藜中的主要化學(xué)成分有甾體皂甙、生物堿、黃酮、氨基酸等物質(zhì)。多數(shù)皂甙極性較大，一般可溶于水，易溶于熱水、稀醇，難溶于丙酮，幾乎不溶于石油醚、苯、乙醚等親脂性溶劑。

表1 水提醇沉法和70%乙醇法提取后樣品的收率(%)

石油醚和乙醚是親脂性有機溶劑，極性較小，只能溶解一些極性小的親脂性物質(zhì)，如脂溶性色素、油脂和蠟。乙醚可以溶解經(jīng)甲醇醇解作用得到的低分子酚類物質(zhì)，這一類型的天然物質(zhì)在蒺藜中所占的比例很小。乙酸乙酯的極性較大，除了溶解前兩者不溶的脂溶性物質(zhì)外，還可溶解黃酮類、蒽醌類物質(zhì)。正丁醇極性更大，對組織細胞的穿透力更強，皂甙類主要可能在這一組分發(fā)現(xiàn)，此外，還可溶解單寧及其它高極性雜質(zhì)。

由表1可看出，梯度提取中，其收率順序為:正丁醇＞乙酸乙酯＞乙醚＞石油醚。

通過比較兩種方法所得粗皂甙重量及收率，可知70%乙醇回流法所得皂甙量和收率均高于水提醇沉法，是較優(yōu)的提取方法。因為水提法在醇沉這一步驟時，將部分皂甙也夾帶沉淀，造成損失。

2.1.2 初步提取分離中的定性檢測

對1.2.1.1索氏提取的各樣品做定性檢驗，結(jié)果見表2。

表2 水提醇沉法所得樣品定性檢測結(jié)果

試驗結(jié)果表明，正丁醇組分三種定性反應(yīng)都呈陽性，說明其中存在皂甙。乙醚和乙酸乙酯組分冰醋酸-乙酰氯反應(yīng)現(xiàn)象呈陰性，醋酐-濃硫酸、氯仿-濃硫酸反應(yīng)現(xiàn)象雖然呈陽性，但不如正丁醇組分明顯，說明乙醚相、乙酸乙酯相中也溶有少量皂甙。石油醚組分的定性反應(yīng)現(xiàn)象都呈陰性，表明皂甙在石油醚中幾乎不溶解。

對70%乙醇回流提取的樣品進行定性檢測，得出的結(jié)果與水提醇沉的樣品相似。

另外，對各組分進行鹽酸-鎂粉反應(yīng)及三氯化鐵反應(yīng)定性檢測。檢測結(jié)果:鹽酸-鎂粉反應(yīng)，乙酸乙酯組分明顯呈陽性，說明乙酸乙酯相中含較多黃酮，其它各相呈陰性，說明各相中不含黃酮或含極少量黃酮;三氯化鐵反應(yīng)，各相均呈陽性(三氯化鐵層呈綠色)，表明各相含酚類物質(zhì)，只是含量有差別。

2.1.3 薄層分離

取索氏提取后的各相液體少量，用薄層層析板進行分離分析。

乙醚相:展開體系為氯仿-丙酮-甲醇，8∶2∶1，碘蒸氣熏顯色后，可顯出三個斑點。

乙酸乙酯相:展開體系為氯仿-丙酮-甲醇，8∶2∶1，碘蒸氣熏顯色后，發(fā)現(xiàn)有單一的點，Rf=0.31;氯仿-乙酸乙酯 -乙酸，5∶5∶1，顯示有三個點，Rf1=0.18，Rf2=0.41，Rf3=0.61。

正丁醇相:展開體系為乙酸乙酯-醋酸-水，8∶2∶1，點在原處，未跑開，因展開劑極性太低;展開體系氯仿 -甲醇 -水，3∶1.5∶0.5，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，因其組分太多。

2.2 正丁醇組分大孔吸附樹脂分離

2.2.1 各濃度洗脫液洗脫出的物質(zhì)重量

將40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脫下的各組分定容至25mL，移液管取5mL于稱量瓶中，烘干至恒重，稱重，計算總物重。結(jié)果見表3。

表3 各濃度洗脫液洗脫出的物質(zhì)重量(g)

固形物量的分布與洗脫液體積、流速及洗脫方式(梯度、平行)有密切關(guān)系。由表3可看出，隨洗脫液濃度的增加，洗脫出固形物的量反而減小。因每個濃度洗脫液體積均為兩個床體，在較低濃度時，皂甙已被分離出來。梯度洗脫時，此種現(xiàn)象必然發(fā)生。若為平行方式，相同體積洗脫液，高濃度洗脫出的物質(zhì)量應(yīng)多于低濃度。

2.2.2 定性檢測

對蒸餾水、不同濃度的乙醇洗脫所得各個組分定性檢驗。

先用兩個床體的蒸餾水洗脫，將其中的糖和蛋白質(zhì)洗盡。跟蹤檢測，直到滴出的液體α-萘酚反應(yīng)現(xiàn)象呈陰性，才可判定其中不含糖。

對20%，30%乙醇洗脫液做泡沫試驗，由于成分復(fù)雜，即便有皂甙純度也不高，無法得出肯定的結(jié)論。30%乙醇洗出的組分經(jīng)鹽酸-鎂粉反應(yīng)檢測，顯紫紅色，表明了黃酮的存在。

取40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脫液分別做定性試驗，發(fā)現(xiàn)均含皂甙。

80%，95%乙醇洗脫，皂甙定性試驗呈陽性，但顏色較弱，顯示含量偏低，估計是由于大部分皂甙已被洗脫出的緣故。

由此可斷定40%乙醇洗脫液中皂甙含量最高。

2.2.3 薄層分析

將收集的經(jīng)大孔樹脂部分純化過的皂甙樣品進行薄層層析，展開體系為氯仿-甲醇-水，65∶35∶10，結(jié)果如圖1所示。

圖1 大孔樹脂柱層析分離后的皂甙

從圖1中可看出僅有一個斑點，Rf=0.86，可知蒺藜皂甙經(jīng)大孔樹脂柱層析后得到進一步純化。

3 結(jié)論

(1)通過測皂甙得率與濃度，將水提醇沉法與70%乙醇回流法比較，證實70%乙醇回流法皂甙的得率較高，是較優(yōu)的提取方法。

(2)經(jīng)大孔樹脂LSA-20純化，皂甙主要存在于40%，50%，55%，60%，65%乙醇洗脫液中，濃縮得較純的皂甙。用薄層分析證實皂甙得到了純化。

［1］Conrada J，Dinchevb D，Klaibera I，et al.Anovel furostanol saponin from Tribulus terrestris of Bulgarian origin［J］.Fitoterapia，2004(75)：117-122.

［2］Combarieu E，F(xiàn)uzzati N，Lovati M，et al.Furostanol saponins from Tribulus terrestris［J］.Fitoterapia，2003(74)：583-591.

［3］張健，李俊.蒺藜提取物的藥理研究進展［J］.中醫(yī)藥研究，1989(6)：56-57.

［4］蔡利鋒，景鳳英，張建國，等.蒺藜化學(xué)成分的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，1999，34(10)：759-761.

［5］北京醫(yī)學(xué)院，北京中醫(yī)學(xué)院編.中草藥成分化學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1980.