陳雪 李海平 張培 曹安民

近年來的研究顯示，視網(wǎng)膜固有的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠持續(xù)表達(dá)與抗原呈遞和促進(jìn)免疫反應(yīng)息息相關(guān)的組織相容性抗原 MHCII，并具有加工抗原的有效機(jī)制。這一現(xiàn)象使人們認(rèn)識(shí)到小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成了視網(wǎng)膜的免疫系統(tǒng)。諸多研究顯示視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞在眼內(nèi)炎癥、視神經(jīng)變性、年齡相關(guān)性黃斑變性以及糖尿病視網(wǎng)膜病變中均有所作用［1］。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤與免疫有著密切的聯(lián)系，很早就有國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)治療的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤可出現(xiàn)腫瘤的自發(fā)退變，而且這一現(xiàn)象并不少見，是所有腫瘤中自發(fā)退變率最高的一種［2］。其退變機(jī)制尚不明確，多數(shù)學(xué)者傾向于與細(xì)胞免疫有關(guān)。在組織病理學(xué)上，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤有豐富的血管和大量的腫瘤壞死區(qū)。在壞死的腫瘤組織周圍通?？梢砸姷胶芏嗔馨图?xì)胞浸潤(rùn);電鏡下可見淋巴細(xì)胞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞及多核巨噬細(xì)胞吞噬變性的腫瘤細(xì)胞現(xiàn)象，提示視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤退變與免疫反應(yīng)的關(guān)系非常密切［3］。

Madigan等［4］早期對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)單核巨噬細(xì)胞聚集在血管周圍區(qū)域，后來證實(shí)這些細(xì)胞是MHCII陽性表達(dá)的小膠質(zhì)細(xì)胞［5］。Krishnakumar等［6］首次將表達(dá) HLA 的細(xì)胞數(shù)量與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的分化和預(yù)后聯(lián)系起來，認(rèn)為在侵襲性較強(qiáng)和分化較差的腫瘤中HLA的表達(dá)被抑制。但他們認(rèn)為這些表達(dá)HLA的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。那么，小膠質(zhì)細(xì)胞作為視網(wǎng)膜中的免疫應(yīng)答感應(yīng)器和效應(yīng)器，在機(jī)體對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的免疫監(jiān)視中有何作用?是否與腫瘤細(xì)胞有直接或間接的聯(lián)絡(luò)?是否與腫瘤細(xì)胞存在相互作用?至今尚無報(bào)道。

本研究通過對(duì)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤標(biāo)本中小膠質(zhì)細(xì)胞的活躍性及其與腫瘤分化程度、腫瘤侵襲性的相關(guān)分析，了解小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的分化程度和分布特點(diǎn)，分析其是否為腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的途徑之一，以期為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 共32例(33眼)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤石蠟標(biāo)本，來源于 John Hopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)院Wilmer眼科研究所，其中高加索人種11例，非洲裔8例，亞裔2例，其他相關(guān)資料不詳。患者年齡2個(gè)月～13歲，平均年齡2.37歲，其中男18例19眼，女14例14眼。雙眼發(fā)病者11例12眼。有13例患者接受過化療或放療。

1.1.2 試劑和儀器 小鼠抗人HLA-DPDQDR單克隆抗體，兔抗人 MAP-2多克隆抗體(Chemicon公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗小鼠IgG抗體(中杉金橋公司)，TRITC標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(中杉金橋公司)，防熒光淬滅封片劑(北京普利萊公司)，二步法兔/鼠通用型免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(DAKO公司)，組織顯微鏡及數(shù)碼相機(jī)(Olympus公司)，510 Meta激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1 組織病理學(xué) 每一例標(biāo)本經(jīng)過體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林固定、石蠟包埋，切片厚度6 μm，蘇木精-伊紅染色后顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)分析。

腫瘤分化情況:高度分化7眼，中度分化13眼，低度分化13眼。判定原則根據(jù)主要分化標(biāo)志的構(gòu)成:(1)高度分化:可見大量Flexner-Winter玫瑰花團(tuán)或者小玫瑰花團(tuán)，大于50%腫瘤面積;(2)中度分化:可見 Homer-Wright或者 Flexner-Winter玫瑰花團(tuán)，但比例小于50%腫瘤面積;(3)低度分化:細(xì)胞核質(zhì)比高，沒有明顯的玫瑰花團(tuán)形成［7］。

腫瘤侵犯情況:無脈絡(luò)膜或視神經(jīng)侵犯者21眼，有脈絡(luò)膜或視神經(jīng)侵犯者共12眼，其中脈絡(luò)膜侵犯者9眼，有視神經(jīng)侵犯者9眼，脈絡(luò)膜和視神經(jīng)均有侵犯者6眼。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 切片常規(guī)脫蠟、水化，抗原修復(fù)，去內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉。分別滴加一抗(1∶500)，4℃濕盒過夜。PBS洗片后，滴加二步法兔/鼠通用型免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑，室溫孵育40 min;PBS洗片后，滴加DAB顯色劑，顯色時(shí)間5 min;水洗終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染核，脫水透明封片。已知表達(dá)MHCII的淋巴組織作為陽性對(duì)照，用PBS代替特異性一抗平行染色作為陰性對(duì)照。

1.2.3 免疫熒光雙標(biāo)染色 切片常規(guī)脫蠟、水化，抗原修復(fù)，血清封閉。先加鼠抗人HLA-DR單克隆抗體(1∶100)，4℃濕盒過夜。PBS洗片后，滴加抗小鼠熒光二抗(1∶100)，室溫避光孵育45 min;PBS洗片后，滴加兔抗人 MAP-2多克隆抗體(1∶500)，室溫避光孵育3 h;PBS洗片后，滴加抗兔熒光標(biāo)記二抗(1∶100)，室溫孵育45 min;PBS洗片后，用防熒光淬滅封片劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。以表達(dá)MHCII的淋巴組織和表達(dá)MAP-2的眼內(nèi)視網(wǎng)膜組織作為陽性對(duì)照，用PBS代替特異性一抗平行染色作為陰性對(duì)照。

1.2.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果的判定 以MHCII作為小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，細(xì)胞漿及細(xì)胞膜出現(xiàn)棕色為陽性。在相同放大倍數(shù)下(×200)進(jìn)行染色陽性細(xì)胞密度的評(píng)分［7］:偶見陽性染色細(xì)胞(同一視野內(nèi)＜10個(gè))，評(píng)分為1;可見較多的陽性染色細(xì)胞(同一視野內(nèi)≥10～50個(gè))，評(píng)分為2;大量陽性染色細(xì)胞(同一視野內(nèi)＞50個(gè))，評(píng)分為3。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 12.0軟件包，對(duì)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，分析MHCII染色陽性細(xì)胞密度與腫瘤分化情況及腫瘤侵犯情況的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MHCII免疫組織化學(xué)染色與腫瘤分化情況

本研究在確定腫瘤分化與MHCII陽性染色細(xì)胞的關(guān)系時(shí)，為便于進(jìn)行方差分析，將腫瘤分化情況分為兩組:低度分化和中高度分化;而將免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞亦分為兩組:評(píng)分1和評(píng)分2或3。

結(jié)果顯示MHCII陽性細(xì)胞的分布與腫瘤分化程度相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OR為4.8，95%可信區(qū)間 1.063～21.676(P=0.041，見表1)。

表1 MHCII陽性細(xì)胞與腫瘤分化情況Table 1 MHCII positive cells and tumor differentiation (eye)

2.2 MHCII免疫組織化學(xué)染色與腫瘤侵犯情況在12例有脈絡(luò)膜或視神經(jīng)侵犯腫瘤患者中，MHCII陽性細(xì)胞評(píng)分為1的病例為6例，占50.00%;評(píng)分為2或3的為6例，占50.00%。在21例無脈絡(luò)膜或視神經(jīng)侵犯腫瘤中，MHCII陽性細(xì)胞評(píng)分為1的病例為7例，占33.33%;評(píng)分為2或3的為14例，占66.67%。在統(tǒng)計(jì)中將MHCII評(píng)分為2或3的病例合為一組，與腫瘤有無侵犯脈絡(luò)膜或視神經(jīng)情況進(jìn)行方差分析，兩者無相關(guān)性。

2.3 MHCII免疫組織化學(xué)染色與前期放化療情況

經(jīng)過前期放化療的腫瘤共13例，MHCII陽性細(xì)胞評(píng)分為1的病例為7例，占53.85%;評(píng)分為2或3的為6例，占46.15%。在沒有經(jīng)過前期放化療的20例腫瘤中，MHCII陽性細(xì)胞評(píng)分為1的病例為6例，占 30.00%;評(píng)分為 2或 3的為 14例，占70.00%。在統(tǒng)計(jì)中將MHCII評(píng)分為2或3的病例合為一組，與前期放化療情況相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 MHCII陽性細(xì)胞的形態(tài)和分布 MHCII陽性細(xì)胞胞體呈圓形，細(xì)胞具有細(xì)長(zhǎng)的突起，胞漿和胞膜染色陽性，形態(tài)符合小膠質(zhì)細(xì)胞(圖1)。這些細(xì)胞分布于腫瘤基質(zhì)和血管近旁區(qū)域，在鈣化灶周圍也可見到，但是在視網(wǎng)膜表面和玻璃體內(nèi)播散的腫瘤細(xì)胞團(tuán)中很少出現(xiàn)。在腫瘤近旁的正常視網(wǎng)膜中也出現(xiàn)明顯增多的MHCII陽性細(xì)胞。

Figure 1 MHCII positive cells with long dendrites(arrows)distributed in tumor stroma，whose phenotype is consistent with microglia(×200)MHCII陽性細(xì)胞分布于腫瘤基質(zhì)中，具有細(xì)長(zhǎng)的突起(箭頭)，形態(tài)符合小膠質(zhì)細(xì)胞(×200)

分化程度有差異的腫瘤組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的分布有所不同。在中高度分化腫瘤區(qū)域中，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較多，集中在腫瘤基質(zhì)當(dāng)中;而在低度分化腫瘤區(qū)域中，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，主要分布于血管近旁(圖2)。

Figure 2 Distribution of MHCII positive cells was associated with tumor differentiation.A:MHCII positive cells populated in tumor stroma at well differentiated area;B:MHCII positive cells only scattered in poorly differentiated area near vessel(×100) 分化程度有差異的腫瘤組織中MHCII陽性細(xì)胞的分布情況。A:在核質(zhì)比較低、細(xì)胞存在明顯分化的區(qū)域中，MHCII陽性細(xì)胞數(shù)量比較多，集中在腫瘤基質(zhì)當(dāng)中;B:在核質(zhì)比較高、細(xì)胞沒有明顯分化的區(qū)域中，MHCII陽性細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，主要分布于血管近旁(×100)

2.5 MHCII與MAP-2免疫熒光雙標(biāo)染色 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的細(xì)胞起源目前尚不十分明確，但多數(shù)腫瘤細(xì)胞表達(dá)微管相關(guān)蛋白 MAP-2。MAP-2免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)MAP-2，而腫瘤組織間的淋巴細(xì)胞無著染(圖3)。

Figure 3 Immunohistochemistry staining on adjacent slides，distribution comparison of MAP-2 positive cells and MHCII positive cells.A:MAP-2 staining showed tumor cells expressed MAP-2 widely，while lymphocytes did not stain(arrows，200);B:MHCII staining showed positive MHCII cells located near the vessel(×200) 鄰近切片免疫組織化學(xué)染色，MAP-2陽性細(xì)胞與MHCII陽性細(xì)胞分布比較。A:MAP-2免疫組織化學(xué)染色，腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)MAP-2，而腫瘤組織間的淋巴細(xì)胞無著染(箭頭，×200);B:MHCII免疫組織化學(xué)染色，MHCII陽性細(xì)胞分布于血管近旁(×200)

MHCII與MAP-2免疫熒光雙標(biāo)染色顯示兩種熒光無疊加，提示表達(dá)MAP-2的腫瘤細(xì)胞不表達(dá) MHCII(圖4)。

Figure 4 Double-labeled immunofluorescence of MAP-2(A)and MHCII(B)showed no overlap(C)，indicating that positive MAP-2 tumor cells did not express MHCII MAP-2(A)與MHCII(B)免疫熒光雙標(biāo)染色顯示兩種熒光無疊加(C)，提示表達(dá)MAP-2的腫瘤細(xì)胞不表達(dá)MHCII

3 討論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤在組織病理學(xué)上的分化特征與腫瘤的惡性程度是相關(guān)的［8］。很早就有文獻(xiàn)提到，相較于有玫瑰花團(tuán)存在的腫瘤而言，分化不良的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤預(yù)后更差［9］。一般認(rèn)為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤來源于神經(jīng)干細(xì)胞或視網(wǎng)膜前體細(xì)胞，一些特征性玫瑰花團(tuán)，尤其是F-W玫瑰花團(tuán)和小玫瑰花團(tuán)的形成，代表著神經(jīng)元分化的初級(jí)狀態(tài)，與胚胎早期光感受器的分化相似［10］。本研究結(jié)果顯示小膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的分化有明顯關(guān)系，在部分分化和分化較好的腫瘤中小膠質(zhì)細(xì)胞的活躍更為明顯。事實(shí)上，在研究過程中也觀察到，即使同一病例在分化程度有差異的腫瘤組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的分布也有所不同。在核質(zhì)比較高，細(xì)胞沒有明顯分化的區(qū)域中，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，主要分布于血管近旁;而在核質(zhì)比較低，細(xì)胞存在明顯分化的區(qū)域中，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較多，集中在腫瘤基質(zhì)當(dāng)中。同時(shí)，明顯增多的小膠質(zhì)細(xì)胞還出現(xiàn)在腫瘤近旁的正常視網(wǎng)膜中。這些現(xiàn)象說明小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜前體細(xì)胞或視網(wǎng)膜干細(xì)胞的分化中可能起到一定作用。

在胚胎發(fā)育的過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞在很早的時(shí)期就進(jìn)入視網(wǎng)膜，參與到神經(jīng)元發(fā)育性凋亡的過程當(dāng)中。小膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)生長(zhǎng)因子是誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)育性凋亡的必要條件［11］。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞能夠在非常早的分化階段與神經(jīng)元發(fā)生相互作用，調(diào)控發(fā)育性細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元突觸的生成。至神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟后，小膠質(zhì)細(xì)胞依然保持對(duì)其微環(huán)境的監(jiān)控，對(duì)相應(yīng)變化做出反應(yīng)。故而，多數(shù)神經(jīng)元的功能為小膠質(zhì)細(xì)胞所調(diào)控，兩者之間存在著持續(xù)不斷的功能性對(duì)話和交流［12］。在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，小膠質(zhì)細(xì)胞是被部分發(fā)育的神經(jīng)元和突觸所發(fā)出的信息而吸引前來調(diào)控發(fā)育性的細(xì)胞凋亡，還是由于慢性活化的小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞中視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的分化，亦或是分化不良的腫瘤細(xì)胞能夠釋放出某種因子抑制小膠質(zhì)細(xì)胞在其周圍的活性?目前尚不得而知。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞之間是否存在直接交流或者通過某種細(xì)胞因子相互作用還需進(jìn)一步研究。

與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤預(yù)后密切相關(guān)的另一個(gè)重要的組織病理學(xué)特征就是腫瘤細(xì)胞侵犯到視網(wǎng)膜之外的組織，如直接侵犯視神經(jīng)或者破壞Bruch膜侵入到脈絡(luò)膜，這些是患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性病灶的最重要的影響因素。在本研究中雖然活化表達(dá)MHCII的小膠質(zhì)細(xì)胞與腫瘤侵襲性的關(guān)聯(lián)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但顯示出一定的趨勢(shì)，在無脈絡(luò)膜或視神經(jīng)侵犯的病例中表達(dá)MHCII的小膠質(zhì)細(xì)胞相對(duì)較多，而在有脈絡(luò)膜或視神經(jīng)侵犯的病例中小膠質(zhì)細(xì)胞相對(duì)較少。小膠質(zhì)細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞表達(dá)MHCII分子對(duì)于機(jī)體識(shí)別腫瘤抗原是至關(guān)重要的。當(dāng)腫瘤免疫呈遞系統(tǒng)發(fā)生缺陷而無法將腫瘤抗原呈遞給免疫細(xì)胞時(shí)，或者腫瘤產(chǎn)生免疫抑制因子，并誘導(dǎo)了免疫抑制反應(yīng)，宿主免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤將不產(chǎn)生免疫反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞就逃脫了免疫系統(tǒng)的監(jiān)控。Schartner等［13］的研究顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的抗原呈遞作用是被抑制的，即使給予了外源性干擾素也僅有輕微的MHCII上調(diào)。這與本研究的結(jié)果:在侵襲性更強(qiáng)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，小膠質(zhì)細(xì)胞的MHCII表達(dá)也有所降低是相一致的。這一抑制機(jī)制暫時(shí)還不清楚，有可能與腫瘤產(chǎn)生的免疫抑制性細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)有關(guān)。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的其他病理學(xué)特征包括腫瘤中存在較多的壞死區(qū)域、常見到有絲分裂像和細(xì)胞凋亡等，這都是在惡性腫瘤中比較常見的現(xiàn)象，但與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的預(yù)后沒有明顯關(guān)聯(lián)。只有超過90%以上面積的大范圍的腫瘤壞死，才可能對(duì)預(yù)后造成影響［14］。雖然化療或放療有可能會(huì)引起腫瘤的壞死，但是通常以膠質(zhì)反應(yīng)性瘢痕為主，不會(huì)引起大面積的壞死［15］。本研究中的樣本包括了13例經(jīng)過前期化療或放療的病例，未見到大面積壞死的病例。在所有病例中，也未見到壞死區(qū)域周圍有明顯的小膠質(zhì)細(xì)胞的聚集。MHCII陽性細(xì)胞評(píng)分在經(jīng)過前期放化療的病例中是均勻分布的，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)化療或放療與MHCII的表達(dá)不相關(guān)。分化較好的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤通常對(duì)化療或放療不敏感。本研究結(jié)果提示，通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞在分化良好的腫瘤中的作用，有可能為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的化療或放療提供輔助治療方法，增加腫瘤對(duì)放化療的敏感性。

綜上所述，小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中是活化的，并且與腫瘤細(xì)胞的分化密切相關(guān)。這一現(xiàn)象是否有可能為視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的化療或放療提供預(yù)后判斷依據(jù)?腫瘤細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞之間是否存在直接交流或者通過某種細(xì)胞因子相互作用?這些問題還有待于更深入的細(xì)胞學(xué)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究來闡釋。

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