趙寧 張瑞君 劉磊 李佳 劉寧寧

白內(nèi)障是世界范圍內(nèi)的主要致盲性眼病。白內(nèi)障囊外摘出及超聲乳化白內(nèi)障吸出聯(lián)合人工晶狀體植入術(shù)是現(xiàn)代治療白內(nèi)障的常用方法。然而晶狀體后囊膜混濁(posterior capsule opacification，PCO)是白內(nèi)障術(shù)后的常見并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者術(shù)后視力［1］。細(xì)胞因子刺激晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells，LEC)增殖，占據(jù)原先無細(xì)胞的后囊膜，是形成PCO的主要原因。細(xì)胞因子與細(xì)胞膜表面分布的相應(yīng)受體結(jié)合后，通過多種途徑將信號(hào)傳遞到胞核內(nèi)，促進(jìn)或抑制特定靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。

在細(xì)胞因子受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，磷脂酰肌醇三磷酸激酶(phosphatidylinositol-3 kinase，PI-3k)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是調(diào)控細(xì)胞骨架及凋亡的重要途徑［2-3］。PKB是PI-3k/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中重要的下游激酶，PKB磷酸化后才能表現(xiàn)出活性［4-5］。已有研究表明，PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與 LEC的遷移、分化［6-7］。而 PTEN是至今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，主要通過其脂質(zhì)磷酸酶活性阻斷PI-3k信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移與黏附，在腫瘤研究領(lǐng)域得到大量證實(shí)［8-10］。本研究旨在為研究白內(nèi)障術(shù)后LEC增殖過程中是否存在PTEN基因?qū)I-3k/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制作用，為防治后發(fā)性白內(nèi)障提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選用中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供的健康白色家兔42只(84眼)，8～10周齡，雌雄各半，體質(zhì)量(1.5±0.3)kg，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(36只)和對(duì)照組(6只)。

1.2 試劑與儀器 PTEN mRNA原位雜交檢測(cè)試劑盒、鼠抗兔PCNA單克隆抗體、小鼠IgG鏈酶親合素生物素復(fù)合物免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidin，DAB)顯色試劑盒、焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)均為武漢博士德公司產(chǎn)品。鼠抗兔 Ser473-R多克隆抗體(美國 Santa Cruz Biotechnology，Inc公司)。RT-PCR 試劑盒、βactin引物由大連寶(Takara)生物工程有限公司提供。PKB引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司提供。CataRhex型超聲乳化儀(瑞士Oerrtli Instrumente AG公司產(chǎn)品);YZ20P型手術(shù)顯微鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司產(chǎn)品);Ax70型顯微鏡系統(tǒng)(日本O-lympus公司產(chǎn)品);顯微圖像分析采用Metamorph軟件(美國UIC公司產(chǎn)品)。

1.3 動(dòng)物模型及標(biāo)本制備 對(duì)照組未做處理;實(shí)驗(yàn)組速眠新(0.1～0.3 mg·kg－1)肌肉注射麻醉，Mydrin-P散瞳，由專人行雙眼透明晶狀體皮質(zhì)吸出術(shù):直徑3.2 mm角鞏膜緣隧道切口，前房注入黏彈劑，行4.0 mm直徑開罐式截囊，注吸皮質(zhì)后切口不縫合。術(shù)后10 g·L－1阿托品眼膏散瞳。分別在術(shù)后1 d、3 d、1周、2周、1個(gè)月和2個(gè)月各處死隨機(jī)選擇的6只實(shí)驗(yàn)組兔。摘除雙眼，在手術(shù)顯微鏡下剪除角膜及虹膜，剪斷晶狀體懸韌帶，取出晶狀體。每組3只(6眼)晶狀體取出后立即用40 g·L－1多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋;然后制作連續(xù)切片，片厚5 μm(玻片經(jīng)體積分?jǐn)?shù)0.1%DEPC處理，并用體積分?jǐn)?shù)0.1%DEPC撈片);分別行HE、PCNA及Ser473-R免疫組織化學(xué)染色、PTEN mRNA原位雜交;以 PBS取代PCNA、Ser473-R一抗作為陰性對(duì)照;已知 PCNA、Ser473-R染色陽性的膀胱癌組織切片作為陽性對(duì)照。每組另3只(6眼)晶狀體取出后，以赤道內(nèi)2.0 mm為界留取赤道部，置滅菌Eppendorf管中，－70℃凍存，待行RT-PCR檢測(cè);以PBS取代PTEN探針及PCNA一抗作為陰性對(duì)照;已知PTEN mRNA染色陽性的乳腺癌組織切片作為陽性對(duì)照。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)PCNA、Ser473-R的表達(dá) 石蠟切片常規(guī)梯度乙醇脫蠟，按試劑說明書操作，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，修復(fù)抗原后，滴加PCNA、Ser473-R一抗和二抗，加 SABC。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。檢測(cè)術(shù)前及術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)PCNA、Ser473-R的表達(dá)。

1.4.2 原位雜交檢測(cè)PTEN mRNA的變化 石蠟切片常規(guī)脫蠟，體積分?jǐn)?shù)0.1%DEPC沖洗，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2于室溫下浸泡10 min，37℃下胃蛋白酶消化10 min;每片滴加地高辛標(biāo)記的PTEN寡核苷酸探針雜交液20 μL，37℃下過夜;雜交后在37℃下梯度SSC充分洗滌，滴加穩(wěn)定液，37℃下靜置5 h;室溫下加封閉液靜置30 min，37℃下生物素化抗地高辛抗體反應(yīng)20 min;DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。檢測(cè)術(shù)前及術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)PTEN mRNA表達(dá)。

1.4.3 RT-PCR檢測(cè)PKB mRNA的表達(dá) 將凍存的兔赤道部晶狀體上皮組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以cDNA為模板，參照 Takara RT-PCR試劑盒方法PCR擴(kuò)增PKB的目的基因。檢測(cè)術(shù)前及術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)PKB mRNA的含量。

1.4.4 結(jié)果分析 免疫組織化學(xué)檢測(cè) PCNA陽性為胞核呈棕黃色，Ser473-R與PKB mRNA陽性表達(dá)信號(hào)為胞漿呈棕黃色，PTEN mRNA陽性表達(dá)信號(hào)為胞漿呈棕黃色。在40倍物鏡下攝取每組切片隨機(jī)選取的晶狀體赤道部視野圖像共6張，轉(zhuǎn)存入計(jì)算機(jī)，用Metamorph軟件計(jì)算標(biāo)本晶狀體赤道部單位面積PCNA和PTEN mRNA陽性細(xì)胞吸光度(A)值。

RT-PCR凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并攝像，經(jīng)Kadak 1D圖像分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)含量。目的基因mRNA的相對(duì)含量=(目的基因mRNA mass值÷內(nèi)參照基因mRNA mass值)×100。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包(12.0版本)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間的對(duì)比分析采用成組設(shè)計(jì)的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。各指標(biāo)之間的相關(guān)性采用Person相關(guān)系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCNA免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組赤道部LEC核可見PCNA弱陽性表達(dá)，胞核被染成弱棕黃色，術(shù)后不同時(shí)期的表達(dá)情況見表1。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1 d時(shí)吸光度(A)值迅速升高為0.86±0.02，與對(duì)照組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，見表1)，提示PCNA的表達(dá)迅速升高;術(shù)后1～7 d PCNA的表達(dá)維持在高水平狀態(tài);2周后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，PCNA表達(dá)逐漸減弱;術(shù)后1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)大致恢復(fù)至術(shù)前狀態(tài)。

2.2 Ser473-R免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組赤道部LEC中Ser473-R的表達(dá)極弱，胞漿中幾乎看不到棕色顆粒，吸光度(A)值最小。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1 d時(shí) A值迅速升高為0.54±0.03，與對(duì)照組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001，見表1);術(shù)后1～3 d Ser473-R的表達(dá)維持在高水平狀態(tài);1周時(shí)，Ser473-R表達(dá)開始減弱;術(shù)后1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)恢復(fù)術(shù)前水平(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兔LEC中Ser473-R與PCNA的吸光度(A)值Table 1 Value of absorption optical density of Ser473-R and PCNA in two groups

2.3 PKB mRNA RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組兔晶狀體上皮組織中PKB表達(dá)產(chǎn)物片段長(zhǎng)為261 bp，內(nèi)參照β-actin為690 bp。從PKB mRNA的相對(duì)含量中可知，PKB mRNA的表達(dá)恒定，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)PKB mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P ＞0.05，見表2)。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兔LEC中PKB mRNA的相對(duì)含量Table 2 Relative content of PKB mRNA in LEC of two groups

2.4 PTEN mRNA原位雜交染色檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組LEC有PTEN mRNA表達(dá)(圖1)，吸光度(A值)為0.54±0.03。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(t=23.099，P ＜0.001，見圖2、表3)，提示 PTEN mRNA 表達(dá)明顯下降;術(shù)后3 d時(shí)，表達(dá)仍處于低水平狀態(tài)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng);術(shù)后1周時(shí)略有恢復(fù)(圖3);2周時(shí)趨于明顯好轉(zhuǎn);術(shù)后1個(gè)月、2個(gè)月時(shí)恢復(fù)術(shù)前水平(表3)。

Figure 1 PTEN mRNA expressed brownish yellow in cytoplasm of LEC in control group 對(duì)照組PTEN mRNA陽性表達(dá)信號(hào)為胞漿呈棕黃色

2.5 PKB mRNA、Ser473-R與 PCNA表達(dá)的相關(guān)性分析 PKB mRNA相對(duì)含量與PCNA的陽性細(xì)胞平均吸光度(A)值呈負(fù)相關(guān)(r=－0.319，P=0.039)。Ser473-R與PCNA的陽性細(xì)胞吸光度(A)值呈明顯正相關(guān)(r=0.955，P ＜0.001)。

Figure 2 PTEN mRNA expressed weak brownish yellow at postoperative 1 day(situ hybridization，×400) 術(shù)后1 d時(shí) PTEN mRNA表達(dá)呈弱陽性(原位雜交，×400)

Figure 3 Expression of PTEN mRNA restored at postoperative 1 week(situ hybridization，×400) 術(shù)后1周時(shí) PTEN mRNA表達(dá)有所恢復(fù)(原位雜交，×400)

表3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兔LEC中PTEN mRNA吸光度(A)值Table 3 Value of absorption optical density of PTEN mRNA in two groups

2.6 PTEN mRNA與PCNA、Ser473-R表達(dá)的相關(guān)性分析 PTEN mRNA與PCNA的陽性細(xì)胞平均吸光度(A)值呈負(fù)相關(guān)(r=－0.954，P ＜0.001)。Ser473-R與PTEN mRNA變化顯著，兩者呈明顯負(fù)相關(guān)(r=－0.969，P ＜0.001)。

3 討論

PCNA是真核細(xì)胞DNA合成所必需的一種核蛋白，是DNA多聚酶δ的輔助因子，是細(xì)胞增殖的可信指標(biāo)［11］。本研究再次以 PCNA作為細(xì)胞增殖指標(biāo)，對(duì)兔晶狀體皮質(zhì)吸出后LEC增殖過程中PKB的表達(dá)情況進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，術(shù)后1 d PCNA表達(dá)迅速增強(qiáng)并達(dá)峰值，說明術(shù)后殘留的LEC此時(shí)已大量進(jìn)入增殖期。隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，PCNA表達(dá)逐漸減弱，術(shù)后1～2個(gè)月時(shí)恢復(fù)術(shù)前水平，說明術(shù)后1個(gè)月是LEC增殖最活躍的時(shí)期。

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組術(shù)后不同時(shí)期PKB mRNA的相對(duì)含量恒定，組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＞0.05)，與文獻(xiàn)報(bào)道 PKB mRNA的表達(dá)不隨細(xì)胞增殖情況而變化的結(jié)果一致［4］。PKB mRNA相對(duì)含量與PCNA的陽性細(xì)胞吸光度(A)值之間呈負(fù)相關(guān)，說明細(xì)胞增殖不依賴PKB的含量，而是與它的活性有關(guān)。

PKB家族蛋白分子為單鏈結(jié)構(gòu)，由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中第412－480位氨基酸構(gòu)成 C末端調(diào)節(jié)區(qū)，富含疏水氨基酸和脯氨酸可以和SH3(SRC同源序列3)區(qū)結(jié)合，有一個(gè)絲氨酸位點(diǎn)(Ser473/Ser474)。當(dāng)調(diào)節(jié)區(qū)的Ser473磷酸化以后，引發(fā)其構(gòu)型改變，解除其對(duì)催化區(qū)的抑制而表現(xiàn)出酶活性，磷酸化的Ser473可代表PKB的活性，Ser473-R可以與磷酸化的 Ser473結(jié)合，從而反映 PKB的活性［12］。Ser473-R在術(shù)后處于高水平狀態(tài)，Ser473-R與PCNA的陽性細(xì)胞吸光度(A)值之間呈明顯正相關(guān)，說明LEC的增殖與PKB的活化密切相關(guān)。

PTEN基因作為一種抑制基因，在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育以及增殖與凋亡中有復(fù)雜而重要的作用。PTEN基因是否在眼內(nèi)調(diào)節(jié)LEC的增殖尚未完全明確，有報(bào)道在先天性后囊下白內(nèi)障時(shí)出現(xiàn)了PTEN基因的突變［13］。在對(duì)照組的兔LEC中我們檢測(cè)到了PTEN mRNA的表達(dá)，說明正常狀態(tài)下的LEC自然的增殖、分化、生長(zhǎng)可能也受到 PTEN mRNA的調(diào)控。術(shù)后1～3 d，PTEN mRNA的表達(dá)明顯減少;1周時(shí)，PTEN mRNA的表達(dá)有所恢復(fù);2周后，逐漸恢復(fù)PTEN mRNA的表達(dá)。在增殖的兔LEC中PTEN mRNA的表達(dá)與PCNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示PCNA和PTEN在控制細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的過程中可能相互拮抗，PTEN可能對(duì)LEC增殖有負(fù)調(diào)控作用。

有研究證實(shí)，PTEN基因是通過影響PI-3k途徑而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的［10］。本研究中Ser473-R與PTEN mRNA之間呈明顯負(fù)相關(guān)，而Ser473-R與PCNA之間呈明顯正相關(guān)，提示PTEN mRNA可能通過抑制Ser473的磷酸化，使PKB活性降低，影響PI-3k通路的形成，從而抑制細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)。在白內(nèi)障術(shù)后，PTEN基因可能通過阻斷 PI-3k信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，對(duì)LEC的增殖有抑制作用。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)PTEN基因的認(rèn)識(shí)逐漸深入，PTEN有非依賴P13K激酶途徑調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)的作用。通過促進(jìn) PTEN基因的表達(dá)來抑制LEC的增殖、分化，是否能防止PCO的發(fā)生，還需要大量的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

1 Huang W ，Huang G，W ang D，Yin Q，F(xiàn)oster PJ，He M.Outcomes of cataract surgery in urban southern China:the Liwan Eye Study［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(1):16-20.

2 Hawkins PT，Anderson KE，Davidson K，Stephens LR.Signalling through Class I PI3Ks in mammalian cells［J］.Biochem Soc Trans，2006，34(Pt 5):647-662.

3 Rajeeve V，Pearce W，Cascante M，Vanhaesebroeck B，Cutillas PR.Polyamine production is downstream and upstream of oncogenic PI3K signalling and contributes to tumour cell growth［J］.Biochem J，2013，450(3):619-628.

4 Hemmings BA，Restuccia DF.PI3K-PKB/Akt pathway［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2012，4(9):a011189.

5 Xue G，Hemmings BA.PKB/Akt-Dependent Regulation of Cell M otility［J］.J Natl Cancer Inst，2013，105(6):393-404.

6 W eber GF，M enko AS.Phosphatidylinositol 3-kinase is necessary for lens fiber cell differentiation and survival［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006，47(10):4490-4499.

7 Xiong W，Cheng BH，Jia SB，T ang LS.Involvement of the PI3K/Akt signaling pathway in platelet-derived growth factor-induced migration of human lens epithelial cells［J］.Curr Eye Res，2010，35(5):389-401.

8 Oudit GY，Penninger JM.Cardiac regulation by phosphoinositide 3-kinases and PT EN［J］.Cardiovasc Res，2009，82(2):250-260.

9 Matsuda S，Kobayashi M，Kitagishi Y.Roles for PI3K/AKT/PTEN Pathway in Cell Signaling of Nonalcoholic Fatty Liver Disease［J］.ISRN Endocrinol，2013;2013:472432.doi:10.1155/2013/472432.

10 Carnero A，Blanco-Aparicio C，Renner O，Link W，Leal JF.T he PT EN/PI3K/AKT signalling pathway in cancer，therapeutic implications［J］.Curr Cancer Drug Targets，2008，8(3):187-198.

11 M ahler M，M iyachi K，Peebles C，F(xiàn)ritzler M J.T he clinical significance of autoantibodies to the proliferating cell nuclear antigen(PCNA)［J］.Autoimmun Rev，2012，11(10):771-775.

12 Fayard E，Xue G，Parcellier A，Bozulic L，Hemmings BA.Protein kinase B(PKB/Akt)，a key mediator of the PI3K signaling pathway［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2010，346:31-56.

13 Boccone L，Dessi V，Serra G，Zibordi F，Loudianos G.Bannayan-Riley-Ruvalcaba syndrome with posterior subcapsular congenital cataract and a consensus sequence splicing PT EN mutation［J］.Am J Med Genet A，2008，146(2):257-260.