游雪云，劉艷秋，吳敏

(1、江西省婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，江西 南昌330006；2、臨川區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 臨川344100)

據(jù)世界衛(wèi)生組織1995年統(tǒng)計(jì)，世界人口的1.6%是β地貧基因攜帶者,中國(guó)是世界高發(fā)區(qū)之一，β地中海貧血 (β-thalassemia,以下簡(jiǎn)稱β地貧)，是由于β珠蛋白基因突變或缺失導(dǎo)致β珠蛋白鏈合成受抑而引起的遺傳性溶血性貧血。我國(guó)人口基數(shù)大，殘疾兒發(fā)生率高，β0純合子或雙重雜合子為致死性異常，β0雜合β+是癥狀嚴(yán)重的存活型地貧，雖大部分能適應(yīng)基本社會(huì)生活，但由于長(zhǎng)期慢性溶血性貧血，導(dǎo)致患者肝脾腫大，生活質(zhì)量極差。目前對(duì)本病缺乏有效的治療方法，篩查是預(yù)防重癥地貧兒出生的最好途徑，而毛細(xì)管電泳能夠定量檢測(cè)HbA、HbF、HbA2含量，可以有效地篩查出高危夫婦[1]；同時(shí)毛細(xì)管電泳具有快速、方便、所需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)。

毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)又叫高效毛細(xì)管電泳，是80年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)，它是電泳與層析相結(jié)合的一種分離方法。為了解全自動(dòng)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)在β地貧篩查中的臨床應(yīng)用價(jià)值，本研究對(duì)986例標(biāo)本分別采用毛細(xì)管電泳和瓊脂糖凝膠電泳 (agarose gel electrophoresis，AGE)進(jìn)行檢測(cè)，并與基因診斷結(jié)果進(jìn)行比較，分析兩種方法的靈敏度和特異度，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2010年10月至2013年9月來(lái)我院進(jìn)行產(chǎn)檢、婚檢或體檢的人群，年齡20至40歲之間，大致可分為4類(lèi)：①血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)MCV或MCH減少；②紅細(xì)胞脆性篩查<60%；③家庭中有地中海貧血攜帶者；④夫婦中有一方為地貧攜帶者而另一方主動(dòng)要求篩查的，以上人群共計(jì)986例。分別進(jìn)行毛細(xì)管血紅蛋白電泳和瓊脂糖凝膠血紅蛋白電泳檢測(cè)，并采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行地貧基因檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑 毛細(xì)管電泳采用法國(guó)Sebia公司生產(chǎn)的Minicap全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及其配套血紅蛋白電泳試劑盒、質(zhì)控品(SEBIA，PN 4778)。瓊脂糖電泳采用法國(guó)Sebia公司生產(chǎn)的Hydrasys Lc電泳儀，及配套的EPSON系統(tǒng)掃描儀。地貧基因診斷試劑盒由深圳益生堂生物企業(yè)有限公司生產(chǎn)提供。血常規(guī)測(cè)定用日本光電6318K全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀。

1.3 方法 986例血標(biāo)本分別進(jìn)行毛細(xì)管區(qū)帶電泳及瓊脂糖血紅蛋白電泳檢測(cè)。(1)全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀平行分析平均紅細(xì)胞體積(MCV)、平均血紅蛋白濃度 (MCH)、血紅蛋白 (Hb)、細(xì)胞分布寬度(RDW)。(2)毛細(xì)管電泳檢測(cè)：將抗凝血標(biāo)本離心沉淀，棄除上層血漿，把裝有血細(xì)胞的試管按順序放在儀器配套的轉(zhuǎn)盤(pán)上(位置1～26)，在轉(zhuǎn)盤(pán)的第27管位置加入裝有溶血?jiǎng)┑脑嚬?，約3h后全部檢測(cè)程序完畢，查看結(jié)果。(3)瓊脂糖血紅蛋白電泳檢測(cè)：標(biāo)本進(jìn)行洗滌、溶血制作溶血液；點(diǎn)樣；選擇相應(yīng)程序進(jìn)行電泳;30min儀器自動(dòng)完成電泳、烘干等步驟；電泳完畢及時(shí)取出膠片，放入儀器染色單元，選擇相應(yīng)程序，儀器自動(dòng)進(jìn)行沖洗、染色、脫色、烘干等步驟；染色結(jié)束，取出膠片，用配套的Hyrys系統(tǒng)掃描出結(jié)果。(4)17種β地貧基因 (41-42、71-72、IVS-II-654、 -28、17、B∑、31、43、 -32、27／28、-29、3O、14-15、CAP、Int、IVS-I-1、IVS-I-5)分析采用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)(RDB)進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)[2,3]血紅蛋白電泳：正常成人HbA2為2.5%～3.5%，并且沒(méi)有出現(xiàn)異常血紅蛋白帶。如出現(xiàn) HbA2≥3.5%和(或)出現(xiàn) HbF＞2.0%，和(或)異常血紅蛋白則判為β地中海貧血表型陽(yáng)性。

1.5 檢測(cè)評(píng)價(jià)指標(biāo) 靈敏度(sensitivity，Se)=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度(specificity，Sp)=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行分析，兩樣本比較用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳和毛細(xì)管電泳分析檢測(cè)結(jié)果986例標(biāo)本中瓊脂糖凝膠電泳檢出β地貧32例(含HbE 4例)，檢出率3.2%，其中2例同時(shí)合并HbF增高，檢出異常Hb8例。毛細(xì)管電泳系統(tǒng)共檢出β地中海貧血35例，檢出率3.5%，其中HbE增高6例，HbA2和HbF同時(shí)增高3例；檢出異常Hb9例。兩種電泳結(jié)果對(duì)照之后我們發(fā)現(xiàn)：瓊脂糖凝膠電泳檢出β地貧32例與毛細(xì)管電泳結(jié)果完全一致，但由于瓊脂糖凝膠電泳對(duì)HbE和HbA2區(qū)帶也不容易單獨(dú)區(qū)分，故漏檢了2例HbE，另外還漏檢了1例HbCS。將兩種血紅蛋白電泳結(jié)果通過(guò)列表分析確定以HbA2≥4.8%為篩查β地貧截?cái)嘀?，而兩種血紅蛋白電泳對(duì)986例標(biāo)本檢測(cè)的同時(shí)均采用PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交法RDB法[4]做進(jìn)一步基因診斷；以此基因診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn) ，然后分別對(duì)兩種血紅蛋白電泳檢測(cè)β地貧表型陽(yáng)性的靈敏度和特異度結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明毛細(xì)管電泳診斷β地貧靈敏度和特異度分別為82.3%和87.6%，瓊脂糖凝膠電泳診斷β地貧靈敏度和特異度分別為77.6%和81.7%，毛細(xì)管電泳檢測(cè)的靈敏度和特異度均高于瓊脂糖凝膠電泳。

2.2 兩種電泳檢測(cè)與基因檢測(cè)結(jié)果比較 986例標(biāo)本中，毛細(xì)管電泳對(duì)35例β地貧檢出與基因檢測(cè)(PCR結(jié)合反向斑點(diǎn)雜交)結(jié)果吻合，而這35例β地貧標(biāo)本通過(guò)瓊脂糖電泳有3例與基因檢測(cè)結(jié)果不吻合，其他標(biāo)本兩種電泳結(jié)果均一致。但兩種電泳均無(wú)法發(fā)現(xiàn)β地貧中合并的α地貧，反向斑點(diǎn)雜交診斷為β地貧的35例攜帶者的基因型分別為：CDs41／42(-TCTT)／N 6 例，-28(A→G)／N 6 例，IVS-2—654(C-T)/N 9 例，CDl7(A→T)／N 5 例，CD43(G→T)／N 2 例，CDs71／72(+A)／N 1 例；診斷為HbE的6例攜帶者的基因型均為CD26(G→A)／N。兩種電泳檢測(cè)與基因診斷結(jié)果的符合率見(jiàn)表1。

表1 兩種電泳檢測(cè)后通過(guò)基因確診的β地貧符合率

3 討論

按照受累的氨基酸鏈來(lái)分類(lèi)，地貧主要有α地貧(α鏈?zhǔn)芾?和β地貧(β鏈?zhǔn)芾?，全球每年約有超過(guò)26000例β地貧患者產(chǎn)生[5],在南方高發(fā)地區(qū)的人群基因攜帶率達(dá)3%～l0%[6]。β地貧可分為重型、中間型、輕型和靜止型基因攜帶者[7]，地貧在我國(guó)南方地區(qū)發(fā)病率很高，其中廣西、廣東、江西、四川發(fā)病率分別高達(dá) 14.95%、4.11%、2.60%、1.92%。而隨著流動(dòng)人口的不斷增加及醫(yī)務(wù)人員對(duì)地貧的逐漸認(rèn)識(shí)和重視及地貧的檢出率也逐年上升。國(guó)內(nèi)外研究[8]結(jié)果表明，在地貧高發(fā)區(qū)，通過(guò)遺傳篩查、遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷選擇性淘汰重癥地貧胎兒，是現(xiàn)實(shí)條件下控制重癥地貧胎兒出生的首要選擇。為了減少地中海貧血的發(fā)病率，江西省婦幼保健院于2010年開(kāi)始把地中海貧血篩查作為一項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，對(duì)檢測(cè)為高風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象建議做進(jìn)一步基因診斷，從而降低重癥患兒的出生率。

β地貧主要表現(xiàn)為HbA2、HbF增高或出現(xiàn)異常血紅蛋白，這些異常Hb分子量和所帶電荷不同于正常Hb，可利用電泳方法加以分離[9]。本文通過(guò)全自動(dòng)毛細(xì)管電泳法檢出β地貧表型陽(yáng)性35例，而瓊脂糖凝膠電泳法檢出32例，主要原因是全自動(dòng)毛細(xì)管電泳法與瓊脂糖凝膠電泳法相比，在血紅蛋白區(qū)帶分辨上還具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)HbE在瓊脂糖凝膠電泳中的表現(xiàn)為在HbA2前后出現(xiàn)淡染的區(qū)帶，而導(dǎo)致掃描不易顯示HbE帶，需要操作人員憑經(jīng)驗(yàn)判斷，如經(jīng)驗(yàn)不足則易漏診。而毛細(xì)管電泳是利用415 nm波長(zhǎng)直接檢測(cè)各組分的百分比，不需要染色，不會(huì)將HbE和HbA2發(fā)生重疊而影響結(jié)果，所以不會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)不出而導(dǎo)致漏診的情況。(2)本研究還發(fā)現(xiàn)全自動(dòng)毛細(xì)管電泳檢出的3例 HbCS中瓊脂糖凝膠電泳僅能檢出2例,表明毛細(xì)管電泳對(duì)微量的異常血紅蛋白檢出率更高，定量更準(zhǔn)確，在檢測(cè)各種異常血紅蛋白比瓊脂糖凝膠電泳更具明顯優(yōu)勢(shì)。另外瓊脂糖凝膠電泳對(duì)HbF＜2.0%的HbF無(wú)法定量，只能掃描出HbA+HbF的量，這與陳星等[10]報(bào)告的結(jié)果基本相符。而全自動(dòng)毛細(xì)管電泳則能直接檢測(cè)出HbF的準(zhǔn)確百分比。毛細(xì)管電泳可直觀顯示HbF、HbCS、HbE的異常區(qū)帶，對(duì)HbF、HbE、HbCS等分辨力較高，可很好地檢測(cè)出這些異常Hb含量，并能夠直接檢測(cè)出準(zhǔn)確百分比。國(guó)外已有毛細(xì)管電泳技術(shù)應(yīng)用于診斷地中海貧血的研究報(bào)導(dǎo)[11-14],由此可見(jiàn)毛細(xì)管電泳在靈敏、快速、準(zhǔn)確等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。

本研究結(jié)果顯示兩種電泳方法篩查β地貧表型陽(yáng)性的靈敏度和特異度都較高，但毛細(xì)管電泳系統(tǒng)檢測(cè)β地貧表型陽(yáng)性符合率高于瓊脂糖血紅蛋白電泳，可見(jiàn)在地貧篩查中毛細(xì)管電泳是一種敏感度和精確度更高的分析方法。地中海貧血的篩查關(guān)系到本地區(qū)人口出生素質(zhì),目前在歐洲的一些地區(qū)，β-地中海貧血的產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷已作為常規(guī)項(xiàng)目開(kāi)展，極大地減少了當(dāng)?shù)氐刂泻Ｘ氀純旱某錾?。我院自開(kāi)展地中海貧血篩查后也幾乎沒(méi)有重度地中海貧血兒的出生，說(shuō)明只要重視地中海貧血的產(chǎn)前篩查及產(chǎn)前診斷，可以大大減少重度地中海貧血患兒的出生。堅(jiān)信不久的將來(lái)遺傳病兒一定能有效控制，我國(guó)人口質(zhì)量將得到相應(yīng)的提高。

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