高樂 覃懷德 何鵬 曾日中
摘 要 天然橡膠主要來源于巴西橡膠樹。海南植膠土壤磷素缺乏,而缺磷會導致橡膠樹生長緩慢、干膠產量降低。本文通過RT-PCR技術從橡膠樹中克隆了一個磷饑餓信號關鍵調控基因HbPHR1,基因全長1 560 bp,包含一個1 476 bp的完整讀碼框(ORF),編碼491個氨基酸,分子量約為53.48 kD。HbPHR1具有MYB結構域和CC結構域,屬于MYB-CC家族成員,為酸性不穩(wěn)定蛋白,具有較強的親水性。進化樹分析表明,HbPHR1與擬南芥AtPHR1、油菜BnPHR1歸為一個亞類。HbPHR1的克隆對解析橡膠樹磷信號轉導機制、創(chuàng)制磷營養(yǎng)高效利用橡膠樹材料具有重要意義。
關鍵詞 橡膠樹 ;磷饑餓 ;HbPHR1 ;生物信息學
分類號 S794.1
天然橡膠是重要的工業(yè)原料和國防戰(zhàn)略物資,主要來源于熱帶樹種——巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)。中國是橡膠消費大國,國內橡膠市場缺口巨大。磷對橡膠樹生長發(fā)育、產排膠具有重要的作用。供磷不足,會致使橡膠幼樹葉片數量明顯減少,根系生長不發(fā)達,干圍增長十分緩慢;對于已開割橡膠樹,會導致乳膠機械穩(wěn)定性下降,出現早凝減產,及膠乳干膠產量降低[1]。海南植膠土壤大部分pH值約4.7,屬于典型的酸性土壤,磷肥利用有效性低,低于我國平均利用率15%~25%[2]。以土壤全磷含量低于0.8~1.0 g/kg、速效磷含量50~80 mg/kg的標準來衡量海南膠園土壤磷素供應水平,目前膠園土壤磷素供應水平仍然處于較差狀態(tài)[3]。因此提高橡膠樹磷營養(yǎng)的利用效率對提高橡膠樹的產量具有重要作用。前人研究表明,AtPHR1在擬南芥磷信號系統(tǒng)中起關鍵作用。AtPHR1具有MYB結構域(MYB domain)和卷曲螺旋結構域[coiled-coil (CC) domain],屬于MYB-CC轉錄因子家族成員。AtPHR1功能缺失會導致磷饑餓誘導基因(AtIPS1、AtRNS1和 At4)表達水平下降,葉片累積花青素[4]。AtPHR1以二聚體形式結合到不完全回文序列(GNATATNC)順式作用元件[5]。已有研究表明,許多磷饑餓誘導基因具有該順式作用元件,表明AtPHR1是磷饑餓信號途徑的關鍵調控因子[6]。目前,關于巴西橡膠樹磷信號途徑的研究較少,本文以擬南芥AtPHR1搜索橡膠樹轉錄組數據庫[7],克隆了橡膠樹磷饑餓信號調控基因HbPHR1,并進行了生物信息學分析。該基因的克隆對橡膠樹磷信號轉導途徑研究及磷養(yǎng)分高效利用具有重要意義。
1 材料與方法
1.1 材料
試驗材料為橡膠樹主裁品種‘熱研7-33-97,通過Hoagland營養(yǎng)液進行磷饑餓脅迫水培處理。磷饑餓脅迫處理水培液磷素的濃度為0 mg/L,收集低磷脅迫處理1 d的根部組織材料,液氮速凍后,-70℃保存。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取及cDNA合成
橡膠樹根部組織RNA提取采用Tang等方法提取[8-9],提取RNA后用DNaseⅠ去除殘留的微量DNA。采用反轉錄試劑盒(Fementas)進行反轉錄合成cDNA。
1.2.2 HbPHR1基因全長的克隆
根據EST拼接的序列設計基因特異性引物:5′端引物:5′-ATGGAGGCACGCCCTGC-3′,3′端引物5′-TTAGGCATCTGTTCTCG-3′。PCR反應的總體系為20 μL,包括1 μL模板、引物各0.4 μL、含MgCl2的緩沖液10 μL、2.5 mmol/L dNTPs Mix 3 μL、1 U的LA Taq DNA聚合酶0.4 μL。PCR擴增程序為95℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 2 min,35個循環(huán);72℃ 5 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物,TaKaRa凝膠回收試劑盒回收純化目的片段,連接在pMD18-T載體上并轉化大腸桿菌DH 5α,挑取正確的克隆送往廣州英俊生物有限公司測序。
1.2.3 HbPHR1基因生物信息學分析
通過NCBI Blastp軟件進行保守結構域分析,利用在線分析工具ProtParam分析蛋白的理化性質,ProtScale在線分析蛋白的親水性,Tmpred在線分析蛋白跨膜結構域。在 NCBI 網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載具有MYB-CC結構域的植物蛋白序列,利用ClustalX1.83 和 MEGA5.1軟件進行基因進化樹分析。
2 結果與分析
2.1 HbPHR1基因的克隆
通過HbPHR1基因特異引物擴增出一條1 500 bp左右的條帶(圖1),所擴增的目的條帶與預測的條帶大小一致。將擴增的 DNA 片段回收測序鑒定,確認該基因全長1 560 bp。
2.2 HbPHR1基因序列分析
HbPHR1基因包含一個1 476 bp的完整讀碼框,編碼491個氨基酸,分子量約為53.48 kD。NCBI結構域分析表明,HbPHR1具有MYB( MYB domain)結構域和CC[coiled-coil (CC) domain]結構域,屬于MYB-CC家族成員,與已知植物PHR1存在較高的同源性(圖2)。ProParam蛋白質的理化分析表明,該蛋白絲氨酸Ser含量最高,為15.7%,其次為谷氨酸Glu(8.4%),含量最低的為半胱氨酸Cys和色氨酸Trp,為1.0%;酸性氨基酸數量(Asp+Glu)為59,堿性氨基酸數量(Arg+Lys)為43,理論等電點pI為5.45,屬于酸性蛋白;不穩(wěn)定系數(Instability index)為63.47,屬于不穩(wěn)定蛋白。
2.3 HbPHR1蛋白的疏水性/親水性分析
利用ProtScale預測HbPHR1蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性。依據氨基酸分值越低親水性越強,分值越高疏水性越強的規(guī)律,可以看出,多肽鏈第29位具有最高的分值1.489和最強的疏水性;第458位具有最低的分值-3.122和最強的親水性。橡膠樹HbPHR1的整條多肽鏈表現為較強的親水性。
2.4 HbPHR1蛋白的跨膜結構分析
根據TMPred分析,只有超過500分的才被認為顯著。HbPHR1蛋白氨基酸序列分值均低于500分的顯著值,故可推測HbPHR1未含有跨膜結構域。
2.5 HbPHR1進化樹分析
將HbPHR1與MYB-CC家族中的擬南芥、水稻、小麥、衣藻、油菜、菜豆成員進行系統(tǒng)進化樹分析(圖4)。分析結果表明,巴西橡膠樹HbPHR1與擬南芥AtPHR1、油菜BnPHR1歸為一個亞類,與水稻[Os-PHR1(NP_0010
50006)、Os-PHR2(AK100065)],小麥[Ta-PHR1-A1(KC218925)、Ta-PHR1-B1(KC286910)、Ta-PHR1-D1(KC286911)]相距較遠。
3 討論與結論
PHR蛋白為植物磷信號轉導關鍵調控蛋白,對植物的生長發(fā)育起著重要作用。過表達AtPHR1提高了擬南芥莖中磷含量,同時提高了磷轉運子、磷酸酶、RNA酶等磷饑餓誘導基因的表達水平[10]。同時AtPHR1還調控擬南芥根系的生長,AtPHR1功能缺失突變體根毛長度變短,而超表達PHR1可在缺磷條件下促進根毛的生長[11]。水稻中分離了2個與AtPHR1同源的基因OsPHR1和OsPHR2,過表達OsPHR2顯著提高莖葉磷含量,甚至會導致磷中毒。過表達小麥Ta-PHR1-A1可以提高磷的吸收及小麥穗粒數,進而提高小麥產量。本研究在橡膠樹中克隆了PHR基因,基因全長1 560 bp,包含一個1 476 bp的完整讀碼框,編碼491個氨基酸,具有MYB結構域和CC結構域,屬于MYB-CC家族成員。不同品系的橡膠樹在磷利用率上存在基因型的差異[12]。HbPHR1基因的克隆為解析橡膠樹磷信號轉導機制提供了研究基礎,為創(chuàng)制磷營養(yǎng)高效利用橡膠樹材料提拱了基因資源,對提高橡膠樹磷素利用效率,節(jié)約磷礦資源,減少環(huán)境污染,促進橡膠樹增產具有重要意義。
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