陳希文等

摘要：采用RT-PCR方法對四川綿陽地區(qū)采集的疑似豬繁殖與呼吸綜合征感染病料進(jìn)行克隆，并對ORF5基因進(jìn)行測序及遺傳進(jìn)化分析。Nsp2基因擴增結(jié)果表明，獲得的15個豬繁殖與呼吸綜合征陽性毒株均為Nsp2基因存在缺失的變異株。ORF5基因測序結(jié)果表明，15株ORF5基因均由603 bp編碼、200 個氨基酸組成，各毒株之間的氨基酸同源性為87.6%～100.0%，與GenBank 中13 株參考毒株的序列同源性在57.2%～99.0%之間，與HUN4、JXA1、TJM、GXHZ12等HP-PRRSV 代表株ORF5的相似性高達(dá)90%～99%。推導(dǎo)氨基酸分析結(jié)果表明，各毒株的ORF5氨基酸序列因各場的不同而差異顯著，存在一些突變位點，同時同一場內(nèi)的不同毒株間的差異也較大，多數(shù)毒株在信號肽、跨膜功能區(qū)都存在突變位點，各毒株的潛在糖基化位點也存在差異；遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，15 株ORF5 序列均屬于北美株，大部分毒株序列與2006年暴發(fā)的JXA1高度同源?？傮w上，各毒株之間沒有呈現(xiàn)明顯的地域性。

關(guān)鍵詞：綿陽；豬繁殖與呼吸綜合征；ORF5基因；克??；遺傳變異

中圖分類號： S852.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0026-04

收稿日期：2013-12-05

基金項目：四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃（編號：2013JY0127）；四川省教育廳自然科學(xué)研究項目（編號：09ZB033）；綿陽師范學(xué)院科研項目（編號：QD204A004）。

作者簡介：陳希文（1977—），男，四川宜賓人，博士，副教授，從事動物疾病防控研究。Tel：（0816）2200065；E-mail：xwch05@163.com。豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種流行于全球的豬烈性傳染病，該病于1987年在美國發(fā)現(xiàn)首例病例后很快就在歐美各國的豬群中引發(fā)了一場空前的“流產(chǎn)風(fēng)暴”，使有關(guān)國家的養(yǎng)豬業(yè)蒙受了災(zāi)難性的經(jīng)濟損失。這種曾被稱為豬神秘病（mystery swine disease，MSD）、豬藍(lán)耳?。╞lue-eared disease of pigs）的豬病現(xiàn)已蔓延至世界各國，是目前造成全球養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟損失嚴(yán)重的疾病之一[1-9]。該病的病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），Wensvoort等在荷蘭首次分離到該病毒[10]，以后在美國、加拿大、歐洲國家、中國以及日本也陸續(xù)分離到[11-13]。該病毒為有襄膜的單股正鏈RNA病毒，含有8個讀碼框，由于其基因組結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄機制與動脈炎病毒相似，1995年國際病毒分類委員會將PRRSV歸屬于動脈炎病毒科 （Arteriuiridae）動脈炎病毒屬 （Arteriuirus）。2006年在中國暴發(fā)的豬高熱病的主要病原就是PRRSV 變異株（高致病性PRRSV），其顯著特點是高發(fā)病率和高死亡率，并引起育肥豬的發(fā)病死亡[14]。PRRSV有8個讀碼框，其中ORF5編碼囊膜糖蛋白GP5，該蛋白是PRRSV 異質(zhì)性最高的結(jié)構(gòu)蛋白，2個基因型間氨基酸的相似性僅50%～55%，北美型不同分離株間GP5 的同源性為89%～94%，歐洲株間的同源性為87.10%～9925%。GP5 也是PRRSV 主要的宿主保護性抗原，參與細(xì)胞免疫和體液免疫，GP5 的變異直接導(dǎo)致PRRSV疫苗株的交叉保護率降低，給該病的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)[15-18]。有研究表明，中國北美型流行毒株可被分為多個亞型，近來又有研究表明中國同時存在著歐洲型PRRSV，這些無疑給該病的防控增加了難度。本研究對四川省綿陽地區(qū)主要豬場PRRS流行毒株 ORF5基因進(jìn)行了克隆和測序，并將測序獲得的ORF5 序列與GenBank 中的參考毒株序列進(jìn)行了比較分析，確定PRRSV 在綿陽地區(qū)豬場的遺傳變異情況和分子流行病學(xué)特征，為PRRSV疫苗毒株的選擇和綜合防控提供了參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

采集綿陽豬場疑似PRRS發(fā)病豬的血，分離血清-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑

Trizol LS Reagent，M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶，AxyPrepTM PlasmidMiniprep Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit，rTaq DNA 聚合酶、DNA Marker DL 2000等購自TaKaRa 公司。

1.3引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank 中收錄的HP-PRRSV JXA1的基因序列（GenBank 登錄號：EF112445.1），利用Primer 5.0 軟件設(shè)計合成能擴增出區(qū)分經(jīng)典株和HP-PRRSV株 Nsp2基因的引物P1、P2（P1：5′-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3′，P2：5′-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3′）以及擴增ORF5全基因的引物P3、P4（P3：5′-GTTTACCCAACGCTCCTTA-3′，P4：5′-ACTGGCGTGTAGGTAATGG-3′）。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，純度級別為PAGE?；蝾A(yù)計擴增長度分別為 768 bp（經(jīng)典株）或678 bp（變異株）和801 bp。

1.4病毒總RNA 的提取

按RNA Trizol試劑說明書提取總RNA，具體方法如下：取500 μL血清，加入1 mL Trizol試劑，勻漿，室溫靜置2～3 min；加入200 μL的三氯甲烷，劇烈振蕩，室溫靜置2～3 min；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入1.0 mL 75%乙醇，振搖，4 ℃ 12 000 r/min離心 5 min；棄去上清，干燥沉淀物（室溫約5 min）；用適量無RNase 水溶解沉淀，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.5RT-PCR 擴增

取10 μL RNA 與1 μL 的20 pmol/μL引物混勻，在PCR 儀中70 ℃下反應(yīng) 5 min，立即冰浴5 min，再加入5×Reaction Buffer 4 μL、2.5 mmol/μL dNTP 4 μL 、RNase Inhibitor 0.5 μL、M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，混勻后置于PCR 儀中，于42 ℃ 1 h、70 ℃ 10 min 下反應(yīng)，獲得cDNA 模板，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于PCR 反應(yīng)。取cDNA 3 μL、10×Buffer 和MgCl2各5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、rTaq DNA 聚合酶0.5 μL、20 pmol/μL上下游引物各1 μL，加ddH2O至終體系50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s（ORF5 片段為1 min），共40 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.6ORF5基因的克隆及測序

參照DNA Purification Kit 說明書回收針對ORF5擴增的目的片段，于4 ℃下與pMD18-T 載體過夜連接，再連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有IPTG 和X-gal的LB 平板上，挑取白斑接種LB 液體培養(yǎng)基后按照說明書提取質(zhì)粒，酶切鑒定后，將鑒定正確的質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行序列測定。

1.7ORF5基因的變異和進(jìn)化分析

利用DNAStar 軟件，將測序獲得的PRRSV ORF5 序列與GenBank 已公布的PRRSV 參考毒株序列進(jìn)行比對分析，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2結(jié)果與分析

2.1PRRSV Nsp2基因的RT-PCR擴增結(jié)果

以擴增能區(qū)分經(jīng)典株和變異株 Nsp2基因的引物P1、P2，對血清樣品進(jìn)行RT-PCR擴增，得到與PRRSV變異株預(yù)期大小一致的特異性片段（678 bp），詳細(xì)結(jié)果見圖1。

2.2PRRSV ORF5基因的克隆及測序

選取15份 Nsp2擴增陽性的樣品，用可以擴增PRRSV ORF5全基因的引物P3、P4進(jìn)行RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果表明，15 份樣品均出現(xiàn)了特異性條帶，長度均約為801 bp（圖2），與預(yù)期大小一致。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、克隆及測序，得到15個PRRSV流行毒株

的ORF5 全基因組序列。

2.3PRRSV ORF5基因的變異分析

基因測序結(jié)果表明，15株ORF5 基因均由603 bp編碼、200 個氨基酸組成，各毒株之間的氨基酸同源性為87.6%～100.0%，與GenBank 中13 株參考毒株的序列差異性不同，其同源性為57.2%～99.0%。15個克隆株與HUN4、JXA1、TJM、GXHZ12等HP-PRRSV 代表株ORF5 的相似性高達(dá)90%～99%，多數(shù)毒株與JXA1高度同源。通過推導(dǎo)氨基酸分析結(jié)果可知，PRRSV各分離株的ORF5 氨基酸序列因各場的不同而差異顯著，存在一些突變位點，同時同一場內(nèi)的不同毒株間差異也較大。另外，克隆到的多數(shù)毒株在信號肽、跨膜功能區(qū)都存在突變位點，各毒株含有的潛在糖基化位點也有所差異，具體結(jié)果見圖3。

2.4系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將15 株ORF5 序列與GenBank 中13株參考毒株進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明15 株ORF5 序列均屬于北美株，大部分毒株序列與2006年暴發(fā)的JXA1和TJM株高度同源。綜合分析各毒株的分布情況可知，總體上各毒株的分群未呈現(xiàn)出明顯的地域性，具體結(jié)果見圖4。

3結(jié)論與討論

PRRSV自1987年在美國發(fā)現(xiàn)首例病例后，迅速向各國蔓延，目前已成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。我國自1996年首次分離到PRRSV后，該病很快傳播到國內(nèi)各豬場。特別是2006 年5 月以后在中國暴發(fā)的由PRRSV 變異毒株引起的“高熱病”造成豬大量死亡，更是引起人們對該病的高度重視，該病已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。本研究收集了綿陽地區(qū)主要規(guī)?；i場的病料，針對PRRSV Nsp2 設(shè)計可以區(qū)分PRRSV 經(jīng)典株和PRRSV 變異株的特異性引物進(jìn)行PRRSV 檢測，結(jié)果表明，HP-PRRSV 陽性率為100%，說明綿陽豬場PRRSV 變異株是主要的流行毒株。

PRRSV 難以防控的一個重要原因是PRRSV 的異質(zhì)性，PRRSV 可通過堿基突變、缺失甚至重組等發(fā)生變異，產(chǎn)生變異毒株。國內(nèi)外流行的PRRSV 分離株之間的序列同源性僅為60%，不同地區(qū)的分離株也存在一定的基因突變，特別是與病毒抗原性相關(guān)的ORF5 編碼的蛋白GP5 變異率最大[19-20]。GP5 變異明顯可能是因為其暴露在囊膜表面并且可以誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，這就意味著GP5 暴露在抗體選擇的壓力下，因而易發(fā)生變異。GP5 的變異會直接導(dǎo)致PRRS 疫苗株的交叉保護率降低，因此對GP5 基因進(jìn)行分析有助于深入了解不同分離株間的基因關(guān)系，眾多關(guān)于PRRSV 多樣性

和進(jìn)化的研究也都是基于GP5 序列的多樣性分析[21-23]。本研究利用DNAStar 軟件對獲得的15株ORF5 序列與GenBank 中的13 株參考毒株進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，ORF5 序列之間的氨基酸同源性為57.2%～100.0%，流行毒株與GenBank 中13 株參考毒株的序列差異性不同，其同源性為57.2%～99.0%，15株分離株與JXA1、TJM、HUN4、GXHZ12等HP-PRRSV 代表株ORF5 的相似性高達(dá)90%～99%，多數(shù)毒株與JXA1高度同源。通過推導(dǎo)氨基酸分析結(jié)果可知，PRRSV各分離株的ORF5 氨基酸序列因各場的不同而存在差異。同時，克隆到的多數(shù)毒株在信號肽、跨膜功能區(qū)都存在突變位點，各毒株含有的潛在糖基化位點也有所不同。

GP5 是PRRSV 等3個主要結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的一種糖蛋白，有研究表明，北美型ORF5 基因存在多個糖基化位點，分別位于30/33/34/35/44/51位氨基酸。這些糖基化位點在病毒蛋白的正確折疊、生物學(xué)特性等方面具有重要作用[24]。由糖基化位點所引起的“糖基屏蔽效應(yīng)”可能導(dǎo)致病毒逃避中和免疫應(yīng)答，使病毒在體內(nèi)持續(xù)感染[25]。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)，不同亞群間糖基化位點的數(shù)量也不同[20]。本研究結(jié)果表明，各場流行毒株毒株在信號肽、跨膜功能區(qū)都存在突變位點，各毒株含有的潛在糖基化位點也有所不同，這些特異性突變位點的發(fā)現(xiàn)為今后PRRSV進(jìn)化關(guān)系的分析提供了參考依據(jù)。

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