孫亮華　劉帥兵　趙衛(wèi)飛

摘要：細菌染色體上的毒素-抗毒素（toxin-antitoxin，TA）系統(tǒng)通過轉錄水平和轉錄后水平調控毒素活性，從而控制細胞的生長速度和死亡，使細菌適應各種環(huán)境脅迫。為了證明集胞藻PCC 6803染色體上relNEs TA系統(tǒng)的轉錄調控，構建了以無啟動子的β-半乳糖苷酶（lacZ）基因為報告基因的重組質粒，并測定含轉錄融合重組質粒的大腸桿菌細胞的β-半乳糖苷酶活性。結果表明，抗毒素RelN能顯著抑制relNEs啟動子的轉錄活性，而毒素RelEs能部分減弱這種抑制作用，提示relNEs系統(tǒng)的編碼產物對該操縱子具有反饋調控作用。

關鍵詞：集胞藻；染色體；毒素-抗毒素系統(tǒng)；relNEs；轉錄調控；轉錄融合重組質粒；β-半乳糖苷酶活性

中圖分類號： Q756文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0040-03

收稿日期：2013-12-09

基金項目：國家自然科學基金（編號：30771176）。

作者簡介：孫亮華（1987—），男，河南信陽人，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物（藍藻）方面的研究。E-mail：slhyspa@163.com。

通信作者：劉朝瑩，博士，主要從事環(huán)境微生物學的教學研究工作。E-mail：melinka@163.com。毒素-抗毒素系統(tǒng)（toxin-antitoxin system，TA）由位于同一操縱子中的抗毒素基因和毒素基因構成，二者共同表達[1]。其中抗毒素基因編碼不穩(wěn)定的抗毒素蛋白，毒素基因編碼穩(wěn)定的毒素蛋白；抗毒素基因編碼的毒素蛋白可被依賴ATP的蛋白酶降解成不穩(wěn)定的抗毒素蛋白，與毒素蛋白相互作用形成TA復合體，可抑制毒素的細胞毒性。TA蛋白復合體可以通過抗毒素蛋白結合于TA系統(tǒng)中啟動子的調控序列上，從而反饋調控TA系統(tǒng)的轉錄[1]。細菌染色體上的TA系統(tǒng)通過轉錄水平和轉錄后水平調控毒素活性，從而控制細胞的生長速度和死亡，使細菌適應各種環(huán)境脅迫[2]。藍藻是一類古老的放氧光合細菌，具有獨特的環(huán)境適應能力能和極強的生態(tài)競爭優(yōu)勢。集胞藻（Synechocystis） PCC6803染色體上的基因ssr1114/slr0664構成TA系統(tǒng)，其中slr0664為毒素基因（relEs），ssr1114為抗毒素基因（relN）[1]?？苟舅氐鞍識elN與RelEs相互作用形成復合體，能夠抑制毒素的毒性作用[2]。目前relNEs TA系統(tǒng)編碼產物對其操縱子是否具有轉錄調控作用尚不清楚。本研究以來源于大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因（lacZ）為報告基因，構建了relNEs操縱子與lacZ的轉錄融合質粒，通過對含有這些質粒的重組菌株的β-半乳糖苷酶活性的分析，確定了該系統(tǒng)的轉錄調控。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌株與質粒試驗菌株為Escherichia coli DH5α，質粒為筆者所在實驗室構建并保存。

1.1.2試劑主要試劑有：鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）、溴化乙錠（EB）、各類抗生素、分子生物學試劑等，均購自寶生物（大連）有限公司。引物合成及DNA測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.1.3儀器主要儀器有：Mastertycler型PCR儀（Eppendorf），722型分光光度計，DY-6025型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀，THZ-82 B型氣浴恒溫振蕩器，HSS-1數(shù)字式超級恒溫浴槽等。

1.2試驗方法

1.2.1菌株、質粒的培養(yǎng)條件將用于質粒克隆的宿主菌Escherichia coli DH5α在37 ℃、LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在含有質粒的大腸桿菌培養(yǎng)基中加入相應的抗生素（硫酸卡拉霉素的工作濃度為50 μg/mL，壯觀霉素的工作濃度為100 μg/mL，雙抗時則各自減半）。

1.2.2重組質粒的構建重組質粒的構建按分子克隆的標準方法進行。以T4 DNA聚合酶獲得平末端化重組DNA。以集胞藻PCC 6803染色體為模板，用特異性引物（表1）通過PCR擴增相應的DNA片段。PCR反應體系按產品的說明設定，所用程序依反應對象設置。

2結果與分析

2.1relNEs操縱子啟動子結構分析

在relNEs操縱子中，抗毒素基因relN位于毒素基因relEs上游，二者有11個核苷酸序列的重疊（ATGTCGAATAA），提示二者可能構成一個二元操縱子，在同一啟動子控制下共轉錄。對relNEs操縱子可能的啟動子區(qū)域進行分析發(fā)現(xiàn)，relN起始密碼子（ATG）上游2個核苷酸處有公認的核糖體結合位點（RBS，GAGGAA）；上游40個核苷酸處有方向重復序列（IR，5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′）；上游126個核苷酸處有啟動子公認的-10序列（TCCTAAAGT），145個核苷酸處存在公認的-35序列（TTGCCA）（圖1）。因此，relNEs啟動子區(qū)域（PrelNEs）含有啟動子的所有組分，PrelNEs可能是具有活性的啟動子。此外，PrelNEs含有轉錄調控因子結合的IR序列，relNEs操縱子編碼產物可能具有反饋調控活性。

2.2relNEs操縱子與lacZ轉錄融合質粒的構建

為了構建relNEs操縱子與lacZ轉錄融合質粒，將含relNEs啟動子和relNEs編碼序列的片段克隆于報告質粒pJS759[2]中無啟動子的報告基因lacZ上游。分別以ssr1114-1/ssr1114-2、ssr1114-1/ssr1114-B、ssr1114-1/slr0664-X為引物，PCR擴增啟動子含PrelNEs、PrelNEs-relN、PrelNEs-relN-relEs片段。將擴增產物分別正向克隆于pMD-18T中，將得到的重組質粒分別命名為pJS370、pJS396、pJS963。用PvuⅡ酶切重組質粒后，回收PrelNEs、PrelNEs-relN、PrelNEs-relN-relEs片段，并將這些回收產物分別與BglⅡ酶切后T4 DNA聚合酶補平末端的pJS759載體連接。以ssr1114-1、lacZ-R為引物，篩選PrelNEs插入方向與lacZ相同的克?。▓D2），所得的重組質粒命名為pJS768、pJS769、pJS978，這些重組質粒分別含轉錄融合片段PrelNEs-lacZ、PrelNEs-relN-lacZ、PrelNEs-relN-relEs-lacZ（圖3-A）。

2.3relNEs啟動子轉錄活性的調控

分別用轉錄融合質粒pJS768、pJS769和pJS978轉化E. coli DH5α，重組菌株分別命名為E. coli DH5α （pJS768）、E. coli DH5α （pJS769）、E. coli DH5α （pJS978）。以含空載體的重組質粒pJS759的菌株E. coli DH5α （pJS765）作為對照，測定各重組菌株細胞的β-半乳糖苷酶活性。圖3-B結果顯示，菌株E. coli DH5α （pJS768）的β-半乳糖苷酶活性顯著高于對照菌株，表明啟動子PrelNEs具有轉錄活性；E. coli DH5α （pJS769）的β-半乳糖苷酶活性顯著低于E. coli DH5α （pJS768） 的β-半乳糖苷酶活性，表明RelN對啟動子PrelNEs具有負調控作用；但重組菌株E. coli DH5α （pJS978）的β-半乳糖苷酶活性高于E. coli DH5α （pJS769），提示RelEs可能抑制RelN的轉錄抑制活性。

3討論與結論

TA系統(tǒng)在轉錄水平和轉錄后水平通過降低抗毒素水平并釋放毒素來激活毒素蛋白活性[1-2]。在正常的生長條件下，連續(xù)合成的抗毒素蛋白與毒素蛋白形成TA蛋白復合體，與操縱子序列結合從而抑制TA操縱子的轉錄。在脅迫條件下，依賴ATP的蛋白酶被激活，抗毒素被降解，TA系統(tǒng)的轉錄水平增加[1-2]。如大腸桿菌中，氨基酸饑餓激活Lon蛋白酶，并降解relBE TA系統(tǒng)的抗毒素蛋白，從而激活該TA系統(tǒng)[3-7]。已證明集胞藻PCC 6803染色體上的操縱子relNEs 編碼relBE家族TA系統(tǒng)，其中relEs為毒素基因，relN為抗毒素基因，分別編碼毒素蛋白RelEs和抗毒素蛋白RelN[1]?？苟舅氐鞍識elN與RelEs相互作用形成復合體，抑制毒素的毒性作用[2]。但與大腸桿菌中的relBE同源系統(tǒng)不同，relNEs系統(tǒng)中的抗毒素可被集胞藻中的Lon和ClpXP2s降解，從而激活該系統(tǒng)的細胞毒性作用。

TA系統(tǒng)抗毒素的DNA結合結構域包括4個不同的家族：Helix-Turn-Helix （HTH）、Ribbon-Helix-Helix （RHH）、AbrB、Phd/YefM[1]。RelN與已知抗毒素無序列同源性，但二級結構分析顯示， 其N末端含有類似于AbrB結構域的

β-α-β結構域，因此屬于AbrB家族的轉錄調控因子[8-10]。本研究通過轉錄融合分析了relNEs操縱子的轉錄調控，結果顯示，RelN可反饋抑制relNEs啟動子的轉錄活性，但RelEs能抑制RelN的轉錄抑制活性；在relNEs啟動子區(qū)域存在一個回文序列5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′，推測抗毒素蛋白RelN可能通過其N末端的類-AbrB結構域與該序列結合，從而反饋抑制relNEs啟動子的轉錄活性。由于在細胞內RelN與RelEs相互作用形成復合體[2]，推測RelN-RelEs可能部分抑制RelN與啟動子中的調控序列結合的能力，從而降低RelN的轉錄抑制活性。但RelN與relNEs的調控序列結合活性、特異性以及蛋白酶Lon和ClpXP2s介導環(huán)境脅迫因子激活該TA系統(tǒng)的過程仍需進一步通過研究證明。

參考文獻：

[1]常家寧，寧德剛. 藍細菌PCC6803染色體上的一對毒素-抗毒素基因的鑒定[J]. 微生物學通報，2009，36（1）：31-36.

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[8]Christensen S K，Pedersen K，Hansen F G，et al. Toxin-antitoxin loci as stress-response-elements：ChpAK/MazF and ChpBK cleave translated RNAs and are counteracted by tmRNA[J]. Journal of Molecular Biology，2003，332（4）：809-819.

[9]Gotfredsen M，Gerdes K. The Escherichia coli relBE genes belong to a new toxin-antitoxin gene family[J]. Molecular Microbiology，1998，29（4）：1065-1076.

[10]Magnuson R，Lehnherr H，Mukhopadhyay G，et al. Autoregulation of the plasmid addiction operon of bacteriophage P1[J]. The Journal of Biological Chemistry，1996，271（31）：18705-18710.

張璠，李德茂，周雨霞. 蝦夷馬糞海膽不同腸道中菌群組成及其PCR-DGGE圖譜分析[J]. 江蘇農業(yè)科學，2014，42（9）：43-45.

2.3relNEs啟動子轉錄活性的調控

分別用轉錄融合質粒pJS768、pJS769和pJS978轉化E. coli DH5α，重組菌株分別命名為E. coli DH5α （pJS768）、E. coli DH5α （pJS769）、E. coli DH5α （pJS978）。以含空載體的重組質粒pJS759的菌株E. coli DH5α （pJS765）作為對照，測定各重組菌株細胞的β-半乳糖苷酶活性。圖3-B結果顯示，菌株E. coli DH5α （pJS768）的β-半乳糖苷酶活性顯著高于對照菌株，表明啟動子PrelNEs具有轉錄活性；E. coli DH5α （pJS769）的β-半乳糖苷酶活性顯著低于E. coli DH5α （pJS768） 的β-半乳糖苷酶活性，表明RelN對啟動子PrelNEs具有負調控作用；但重組菌株E. coli DH5α （pJS978）的β-半乳糖苷酶活性高于E. coli DH5α （pJS769），提示RelEs可能抑制RelN的轉錄抑制活性。

3討論與結論

TA系統(tǒng)在轉錄水平和轉錄后水平通過降低抗毒素水平并釋放毒素來激活毒素蛋白活性[1-2]。在正常的生長條件下，連續(xù)合成的抗毒素蛋白與毒素蛋白形成TA蛋白復合體，與操縱子序列結合從而抑制TA操縱子的轉錄。在脅迫條件下，依賴ATP的蛋白酶被激活，抗毒素被降解，TA系統(tǒng)的轉錄水平增加[1-2]。如大腸桿菌中，氨基酸饑餓激活Lon蛋白酶，并降解relBE TA系統(tǒng)的抗毒素蛋白，從而激活該TA系統(tǒng)[3-7]。已證明集胞藻PCC 6803染色體上的操縱子relNEs 編碼relBE家族TA系統(tǒng)，其中relEs為毒素基因，relN為抗毒素基因，分別編碼毒素蛋白RelEs和抗毒素蛋白RelN[1]?？苟舅氐鞍識elN與RelEs相互作用形成復合體，抑制毒素的毒性作用[2]。但與大腸桿菌中的relBE同源系統(tǒng)不同，relNEs系統(tǒng)中的抗毒素可被集胞藻中的Lon和ClpXP2s降解，從而激活該系統(tǒng)的細胞毒性作用。

TA系統(tǒng)抗毒素的DNA結合結構域包括4個不同的家族：Helix-Turn-Helix （HTH）、Ribbon-Helix-Helix （RHH）、AbrB、Phd/YefM[1]。RelN與已知抗毒素無序列同源性，但二級結構分析顯示， 其N末端含有類似于AbrB結構域的

β-α-β結構域，因此屬于AbrB家族的轉錄調控因子[8-10]。本研究通過轉錄融合分析了relNEs操縱子的轉錄調控，結果顯示，RelN可反饋抑制relNEs啟動子的轉錄活性，但RelEs能抑制RelN的轉錄抑制活性；在relNEs啟動子區(qū)域存在一個回文序列5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′，推測抗毒素蛋白RelN可能通過其N末端的類-AbrB結構域與該序列結合，從而反饋抑制relNEs啟動子的轉錄活性。由于在細胞內RelN與RelEs相互作用形成復合體[2]，推測RelN-RelEs可能部分抑制RelN與啟動子中的調控序列結合的能力，從而降低RelN的轉錄抑制活性。但RelN與relNEs的調控序列結合活性、特異性以及蛋白酶Lon和ClpXP2s介導環(huán)境脅迫因子激活該TA系統(tǒng)的過程仍需進一步通過研究證明。

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2.3relNEs啟動子轉錄活性的調控

分別用轉錄融合質粒pJS768、pJS769和pJS978轉化E. coli DH5α，重組菌株分別命名為E. coli DH5α （pJS768）、E. coli DH5α （pJS769）、E. coli DH5α （pJS978）。以含空載體的重組質粒pJS759的菌株E. coli DH5α （pJS765）作為對照，測定各重組菌株細胞的β-半乳糖苷酶活性。圖3-B結果顯示，菌株E. coli DH5α （pJS768）的β-半乳糖苷酶活性顯著高于對照菌株，表明啟動子PrelNEs具有轉錄活性；E. coli DH5α （pJS769）的β-半乳糖苷酶活性顯著低于E. coli DH5α （pJS768） 的β-半乳糖苷酶活性，表明RelN對啟動子PrelNEs具有負調控作用；但重組菌株E. coli DH5α （pJS978）的β-半乳糖苷酶活性高于E. coli DH5α （pJS769），提示RelEs可能抑制RelN的轉錄抑制活性。

3討論與結論

TA系統(tǒng)在轉錄水平和轉錄后水平通過降低抗毒素水平并釋放毒素來激活毒素蛋白活性[1-2]。在正常的生長條件下，連續(xù)合成的抗毒素蛋白與毒素蛋白形成TA蛋白復合體，與操縱子序列結合從而抑制TA操縱子的轉錄。在脅迫條件下，依賴ATP的蛋白酶被激活，抗毒素被降解，TA系統(tǒng)的轉錄水平增加[1-2]。如大腸桿菌中，氨基酸饑餓激活Lon蛋白酶，并降解relBE TA系統(tǒng)的抗毒素蛋白，從而激活該TA系統(tǒng)[3-7]。已證明集胞藻PCC 6803染色體上的操縱子relNEs 編碼relBE家族TA系統(tǒng)，其中relEs為毒素基因，relN為抗毒素基因，分別編碼毒素蛋白RelEs和抗毒素蛋白RelN[1]?？苟舅氐鞍識elN與RelEs相互作用形成復合體，抑制毒素的毒性作用[2]。但與大腸桿菌中的relBE同源系統(tǒng)不同，relNEs系統(tǒng)中的抗毒素可被集胞藻中的Lon和ClpXP2s降解，從而激活該系統(tǒng)的細胞毒性作用。

TA系統(tǒng)抗毒素的DNA結合結構域包括4個不同的家族：Helix-Turn-Helix （HTH）、Ribbon-Helix-Helix （RHH）、AbrB、Phd/YefM[1]。RelN與已知抗毒素無序列同源性，但二級結構分析顯示， 其N末端含有類似于AbrB結構域的

β-α-β結構域，因此屬于AbrB家族的轉錄調控因子[8-10]。本研究通過轉錄融合分析了relNEs操縱子的轉錄調控，結果顯示，RelN可反饋抑制relNEs啟動子的轉錄活性，但RelEs能抑制RelN的轉錄抑制活性；在relNEs啟動子區(qū)域存在一個回文序列5′-TTCCGGACGGC-4N-GCCTAGATGGA-3′，推測抗毒素蛋白RelN可能通過其N末端的類-AbrB結構域與該序列結合，從而反饋抑制relNEs啟動子的轉錄活性。由于在細胞內RelN與RelEs相互作用形成復合體[2]，推測RelN-RelEs可能部分抑制RelN與啟動子中的調控序列結合的能力，從而降低RelN的轉錄抑制活性。但RelN與relNEs的調控序列結合活性、特異性以及蛋白酶Lon和ClpXP2s介導環(huán)境脅迫因子激活該TA系統(tǒng)的過程仍需進一步通過研究證明。

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