王志強(qiáng)++俞紅賢等

摘要：通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆牦牛SLC25A6基因的cDNA序列，并利用DNAMAN、MAGA 6、SWISS-MODEL、ExPASy 等生物信息學(xué)軟件系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分析。結(jié)果表明，擴(kuò)增出的牦牛SLC25A6基因的編碼區(qū)長(zhǎng)897 bp，編碼298個(gè)氨基酸；與普通牛、綿羊和人的相應(yīng)基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，序列一致性分別為99.33%、98.22%、91.86%；其編碼蛋白分子量為32.821 ku，含多個(gè)修飾位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：牦牛；線粒體；SLC25A6基因；ANT3蛋白；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： Q753文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0036-04

收稿日期：2014-03-19

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31260588）；青海省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2011-Z-901）。

作者簡(jiǎn)介：王志強(qiáng)（1988—），男，河南焦作人，碩士研究生，主要從事高原家畜形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與高原環(huán)境的關(guān)系研究。E-mail：wzqqhu@163.com。

通信作者：荊海霞，博士，副教授，主要從事高原家畜形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與高原環(huán)境的關(guān)系研究。E-mail：jinghaixia1@163.com。線粒體作為機(jī)體能量供應(yīng)站，通過(guò)對(duì)組織氧的利用為細(xì)胞的能量代謝提供不可或缺的能量貨幣——三磷酸腺苷（ATP）。因此，長(zhǎng)期生活在氧氣相對(duì)缺乏的高原環(huán)境中的牦牛對(duì)氧氣及能量的充分利用顯得尤為重要。而在能量代謝過(guò)程中，溶質(zhì)載體家族25（solute carrier family 25，SLC25）發(fā)揮著重要作用。SLC25是一類能夠?qū)⒋罅糠肿油ㄟ^(guò)線粒體膜進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白[1]。除SLC25A17外，其余SLC25s均位于線粒體內(nèi)膜，因此被認(rèn)為是線粒體載體[2]。線粒體載體家族中的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3（ADP/ATP translocase 3）別稱ANT3，由SLC25A6基因編碼，是線粒體內(nèi)膜上重要的載體蛋白，能夠促進(jìn)ATP與二磷酸腺苷（ADP）之間的交換。ANT在為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供能量的同時(shí)，也為線粒體基質(zhì)內(nèi)氧化磷酸化反應(yīng)提供底物，促使胞質(zhì)耗能與線粒體產(chǎn)能這一反應(yīng)鏈有序進(jìn)行[3]。有研究顯示，ANT3是白細(xì)胞介素-4（IL-4）和干擾素-γ（IFN-γ）反向調(diào)節(jié)的新靶點(diǎn)，與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系；IL-4或IFN-γ單獨(dú)作用于T細(xì)胞時(shí)能夠上調(diào)ANT3及其基因水平的表達(dá)，當(dāng)IL-4與IFN-γ共同作用時(shí)能夠下調(diào)ANT3的表達(dá)水平。相反，ANT的其他亞型不受IL-4或 IFN-γ 影響；另外，地塞米松誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生的IL-4和IFN-γ細(xì)胞因子通過(guò)調(diào)節(jié)ANT3表達(dá)水平而影響調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的存活率[4-5]。ANT3的瞬間過(guò)量表達(dá)會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，但該凋亡現(xiàn)象能夠被米酵酸菌或環(huán)孢菌素A所抑制[6]。目前，對(duì)高原牦牛腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究幾近空白，因此本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)牦牛腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因及其表達(dá)蛋白進(jìn)行研究，以期揭示高原牦牛線粒體的低氧適應(yīng)機(jī)制，并為高原醫(yī)學(xué)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物來(lái)源及樣品處理

于海拔4 k m左右的青海省大通種牛場(chǎng)選取健康成年牦牛，頸動(dòng)脈放血致死，迅速取腦組織皮層樣本，將其置于液氮中低溫保存，用于提取總RNA。

1.2方法

1.2.1設(shè)計(jì)并合成引物通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）查詢普通牛SLC25A6基因的mRNA序列（NM_174660.2），并根據(jù)其序列利用DNAMAN、Primer 5設(shè)計(jì)特異性引物；共設(shè)計(jì)2對(duì)引物，分別用于擴(kuò)增牦牛目的基因的5′端及3′端，記為引物1、引物2，預(yù)計(jì)其擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度分別為401、651 bp；引物設(shè)計(jì)后，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

1.2.2總RNA的提取利用RNAsimple Total RNA Kit試劑盒提取牦牛總RNA。使用BIO-RAD核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA濃度及純度，同時(shí)利用紫外透視儀對(duì)RNA凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3RT-PCR反應(yīng)及SLC25A6基因擴(kuò)增利用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，該反應(yīng)體系為20 μL。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)加樣體系如下：模板1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ddH2O2 105 μL，solarbio 2×Taq PCR MasterMix（含染料）12.5 μL。引物1的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃變性 30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。引物2的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性 30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4克隆SLC25A6基因并驗(yàn)證利用solarbio瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，與pMD19-T vector在16 ℃下連接1 h；然后經(jīng)42 ℃熱擊及冰浴等反應(yīng)與大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行連接，將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素（Amp）、5-溴-4氯-3吲哚基-β-D-半乳糖（X-gal）和異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h；挑取白色陽(yáng)性單菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h。利用通用引物對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定，再對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序。

1.3數(shù)據(jù)處理分析

牦牛SLC25A6基因的CDS區(qū)測(cè)序結(jié)果，用DNAMAN、MAGA 6、SWISS-MODEL、ExPASy等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行DNA序列拼接、結(jié)構(gòu)分析、編碼蛋白的氨基酸序列預(yù)測(cè)、蛋白的性質(zhì)分析和三維結(jié)構(gòu)構(gòu)建。比較牦牛SLC25A6核苷酸序列及氨基酸序列與普通牛、綿羊、人的一致性。

2結(jié)果與分析

2.1提取的總RNA檢測(cè)結(jié)果

利用BIO-RAD核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)得RNA的純度D260 nm/D280 nm值及濃度分別為1.985、1.056 μg/μL。凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

2.2SLC25A6基因擴(kuò)增結(jié)果及克隆后驗(yàn)證結(jié)果

SLC25A6基因擴(kuò)增片段及克隆后片段長(zhǎng)度均與預(yù)計(jì)長(zhǎng)度相符（圖2），經(jīng)轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子測(cè)序鑒定正確。

2.3牦牛SLC25A6基因的核苷酸序列及其編碼蛋白氨基酸序列

拼接SLC25A6基因5′端及3′端測(cè)序結(jié)果顯示，拼接后序列全長(zhǎng)968 bp，其中CDS序列長(zhǎng)897 bp，CDS序列中堿基組分為腺嘌呤18.6%、鳥(niǎo)嘌呤32.2%、胸腺嘧啶17.2%、胞嘧啶32%。SLC25A6基因共編碼298個(gè)氨基酸（圖3），其中精氨

酸、甲硫氨酸、脯氨酸分別占總氨基酸殘基的6.04%、268%、2.35%。

2.4牦牛SLC25A6基因及其編碼蛋白的氨基酸序列與其他物種的一致性

將牦牛的SLC25A6基因及其編碼蛋白的氨基酸序列與普通牛（Bos taurus）、綿羊（Ovis aries）和人（homo sapiens）等物種的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果與牛、綿羊和人在核苷酸序列上的一致性分別為99.33%、98.22%、91.86%，在相應(yīng)的氨基酸序列上的一致性分別為100.00%、99.66%、97.65% （表2），說(shuō)明SLC25A6基因及其編碼蛋白氨基酸序列在牦牛、普通牛、綿羊和人之間具有較高的一致性，該基因的編碼蛋白在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)較保守。

表2牦牛與普通牛、綿羊、人基因序列及氨基酸序列一致性比較

物種基因序列一致性（%）氨基酸序列一致性（%）牦牛普通牛羊牦牛普通牛羊普通牛99.33100.00綿羊98.2297.7799.6699.66人91.8691.5392.0897.6597.6597.99

利用MAGA 6構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用的算法、模型、可信度評(píng)估方法分別為NJ算法、Tajima-Nei模型、自舉法，自舉法重復(fù)取樣1 000次（圖4）。

2.5牦牛SLC25A6蛋白的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)

牦牛SLC25A6基因CDS序列編碼肽鏈分子量約為32821 ku，DNAMAN預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)為10.35，為堿性蛋白。

功能域位點(diǎn)包括1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（244～251）；1個(gè)酰胺化位點(diǎn)（242～245）；1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（178～181）；4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（150～152、197～199、233～235、242～244）；3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（148～151、150～153、165～168）；13個(gè)N-?；稽c(diǎn)（15～20、16～21、53～58、73～78、115～120、120～125、121～126、156～161、172～177、193～198、253～258、273～278、281～286）。

腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體標(biāo)志性多肽（RRRMMM模體）氨基酸殘基位置為235～240。腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體特征性保守序列PX（D/E）XX（K/R）氨基酸殘基序列分別為PIERVK、PLDFAR、PFDTVR，3條保守序列氨基酸殘基位置分別為28～33、133～138、230～235。

通過(guò)NPS@IBCP服務(wù)器的SOPMA預(yù)測(cè)ANT3的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。其中，α-螺旋占50.67%、β-轉(zhuǎn)角占805%、無(wú)規(guī)卷曲占25.84%、延伸鏈占15.44%。

利用腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（PDB：1okc.1.A，分辨率 2.20 ）作為ANT3結(jié)構(gòu)建模的參考蛋白，通過(guò)同源建模服務(wù)器SWISS MODEL建立牦牛ANT3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6）[7-8]。

3結(jié)論與討論

腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的主要作用是實(shí)現(xiàn)線粒體內(nèi)外ATP與ADP的交換。腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)只能識(shí)別不與Mg2+形成復(fù)合體的腺嘌呤核苷酸，不能與其余的核苷酸相結(jié)合；腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體這一功能的實(shí)現(xiàn)與其蛋白結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[1]。

腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體具有3個(gè)重復(fù)的同源序列，每個(gè)序列約由100個(gè)氨基酸殘基組成，其中有24個(gè)相同或同源替換的氨基酸殘基[9]。3個(gè)重復(fù)的同源序列各形成2個(gè)α-螺旋，α-螺旋相對(duì)于膜及彼此之間都是傾斜的。6個(gè)α-螺旋形成1個(gè)緊湊的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域表面朝向線粒體膜間隙，形成1個(gè)錐形凹陷。錐形凹陷最大直徑為20 ，深30 ；在結(jié)構(gòu)域的底部有1段腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的標(biāo)志性多肽——RRRMMM，多肽中精氨酸與腺苷酸的結(jié)合有關(guān)，而甲硫氨酸則與控制轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)程有關(guān)，RRRMMM模體中精氨酸的突變會(huì)破壞腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性；底物結(jié)合到結(jié)構(gòu)域底部時(shí)，腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體構(gòu)象瞬間從“凹”變?yōu)椤巴ǖ馈睜?，致使底物移位[1]。

腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體也有一個(gè)標(biāo)志性的模體，含有P-X-[D/E]-X-X-[R/K]特征性序列，在線粒體溶質(zhì)載體家族的所有成員及其3個(gè)重復(fù)序列中相對(duì)保守[10]。其中，脯氨酸在轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中充當(dāng)鉸鏈作用，通過(guò)拉直部分α-螺旋鏈，使腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，打開(kāi)蛋白通道，為ADP/ATP的成功運(yùn)輸提供條件[1]。

本研究通過(guò)克隆并分析SLC25A6基因序列，研究其表達(dá)的氨基酸序列及其蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，SLC25A6基因CDS序列長(zhǎng)897 bp，與普通牛、綿羊和人在核苷酸序列上的一致性分別為99.33%、98.22%、91.86%；普通牛與牦牛CDS序列相比，突變點(diǎn)發(fā)生在第72、102、123、378、477、660位點(diǎn)，基因序列相對(duì)保守。SLC25A6基因共編碼298個(gè)氨基酸，其中對(duì)腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體活性起關(guān)鍵作用的精氨酸占氨基酸殘基總量的6.04%，與綿羊和人在氨基酸序列上的一致性分別為99.66%、97.65%；由于堿基突變點(diǎn)均發(fā)生在密碼子第3位核苷酸上，而第3位核苷酸的改變并不會(huì)影響所編碼的氨基酸，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)牦牛與普通牛氨基酸序列一致性為100%，表明該基因的編碼蛋白在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)較保守。該蛋白包含1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)酰胺化位點(diǎn)、1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、13個(gè)N-?；稽c(diǎn)；在ANT3中，標(biāo)志性多肽（RRRMMM模體）氨基酸殘基位置為235～240，特征性保守序列PX（D/E）XX（K/R）氨基酸殘基序列分別為PIERVK、PLDFAR、PFDTVR。

本研究結(jié)果為以后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白免疫印跡等相關(guān)試驗(yàn)提供了理論依據(jù)，有利于深入探討高原低氧環(huán)境對(duì)牦牛腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)構(gòu)及功能的影響。

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：40-42.

本研究結(jié)果為以后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白免疫印跡等相關(guān)試驗(yàn)提供了理論依據(jù)，有利于深入探討高原低氧環(huán)境對(duì)牦牛腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)構(gòu)及功能的影響。

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：40-42.

本研究結(jié)果為以后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白免疫印跡等相關(guān)試驗(yàn)提供了理論依據(jù)，有利于深入探討高原低氧環(huán)境對(duì)牦牛腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)構(gòu)及功能的影響。

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