摘要：以陜南10種主栽黑木耳品種的營養(yǎng)菌絲為材料進行酯酶（EST）同工酶的分析。結果表明，供試的黑木耳菌株酶帶數為3～5條，且相對遷移率為0.615和0.510處的2條酶帶10個菌株都具有，其相似性在0.375～1.000之間。應用NTSYS-pc軟件進行聚類分析，耳91和耳268、耳238和耳913的相似性系數為1.000，表明其親緣較近；耳801和耳238、耳913、國興1號的相似性系數僅為0.375，表明耳801與其他3株菌種的親緣性關系均較遠。研究結果為陜南黑木耳的親緣關系和遺傳育種研究奠定了理論基礎。

關鍵詞：黑木耳；栽培種；酯酶同工酶；陜南

中圖分類號： S646.603文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0193-04

收稿日期：2014-07-16

基金項目：陜西省科學技術研究發(fā)展計劃（編號：2014K01-16-03）；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃（編號：2012HBGC-20）。

作者簡介：彭浩（1979—），男，陜西安康人，碩士，實驗師，從事微生物學及儀器分析的相關教學科研工作。Tel：（0916）2641863；E-mail：penghaooo@snut.edu.cn。

通信作者：陳文強，教授，碩士生導師，從事微生物資源開發(fā)保護及利用相關研究。Tel：（0916）2642832；E-mail：wenqiangc@126.com。同工酶（isoenzyme）是具有相同或相近生物化學催化功能而酶蛋白質分子結構不同的一類酶[1-3]。同工酶蛋白分子構型的相似性可反映出生物種群間的親緣關系，在進行種和種以下的分類時可以通過分析同工酶提供理論依據[4]。同工酶技術鑒定不同食用菌的方法與傳統(tǒng)形態(tài)學方法相比具有很大的優(yōu)勢，首先是省時省力，其次是準確度高、操作簡單[5-7]，在食用菌菌種鑒定和不同食用菌菌種間親緣關系的研究、食用菌誘變育種、食用菌雜交和種質資源遺傳圖譜及連鎖群識別中均有著重要的地位，在食用菌育種研究領域已被廣泛應用[8-10]。近年來，國內胡國元等[11]、馮改靜[12]、楊立紅等[13]、張瑾等[14]分別以金針菇、平菇、香菇、白靈菇、灰樹花等不同食用菌為研究材料，進行菌絲酯酶同工酶的研究，結果表明，酯酶同工酶標記是對食用菌進行遺傳分析或生化鑒定中的最適標記手段之一。

黑木耳是我國傳統(tǒng)的食用菌商品之一，已有2 000多年的人工種植歷史。據統(tǒng)計，最近幾十年，中國的黑木耳產量一直位居世界第一，是我國出口食用菌的主要產品。黑木耳也是地處秦嶺腹地的陜南地區(qū)食用菌的主栽品種之一。近年來，在黑木耳種植過程當中，一些栽培品種出現(xiàn)不同程度的退化、老化和變異，導致黑木耳栽培性狀和產量的不確定，主要表現(xiàn)在一些栽培菌株的生物學效率差別顯著，口感和形態(tài)特征也有很大差異，這些由退化導致的因素嚴重損害了當地菇農的利益。研究人員發(fā)現(xiàn)，當原始菌株在連續(xù)傳種傳代10代后，其產量下降最多可達30%[15-16]。大多數種植區(qū)對黑木耳菌株管理存在很多缺陷，導致同一菌株被冠以不同的品種代號，造成菌種、品種混亂。因此，開展黑木耳種質資源研究，選育穩(wěn)產高產的黑木耳菌株勢在必行。

目前，陜南地區(qū)主栽黑木耳品種酯酶同工酶酶譜系統(tǒng)分析的相關研究報道甚少。本研究選取10株陜南地區(qū)栽培較為廣泛的黑木耳為材料進行酯酶同工酶的分析。通過垂直板聚丙烯凝膠電泳，根據酯酶同工酶電泳譜圖繪制模式圖并分析酯酶同工酶的多樣性，計算菌株之間的相似性系數并構建聚類分析圖，分析菌株之間的親緣關系，旨在對該地區(qū)主栽的黑木耳菌種進行親緣關系的確定，以及為今后高產菌株的選育提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌種耳91、耳238、耳268、耳629、耳801、耳913、秦單3#、秦單4#、新科1號、國興1號等10株菌株由陜西省食藥用菌工程技術研究中心提供。

1.1.2主要儀器超凈工作臺（SW-CJ-IF型，蘇州安泰生物科技公司），生化培養(yǎng)箱（5PX-250B5H-Ⅱ型，上海新苗生物科技有限公司），立式壓力蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-50SⅡ型，上海博迅生物科技公司），電子天平（BSA8201型，北京賽多利斯生物科技公司），電泳儀（DY-11型，北京六一生物科技有限公司），掃描儀（V330E型，上海愛普生生物科技有限公司）。

1.1.3主要藥品和試劑葡萄糖，瓊脂，蛋白胨，75%乙醇，KH2PO4，MgSO4·7H2O，維生素B1，丙酮，36%醋酸，超純水，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，堅牢藍，α-乙酸萘酯，β-乙酸萘酯，蔗糖，阿魏酸。

1.1.4培養(yǎng)基CPDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯20.0 g，葡萄糖 2.0 g，瓊脂2.0 g，KH2PO4 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，維生素B1 1.0 mg，水100.0 mL，pH值自然。

樣品制備液體培養(yǎng)基：洋蔥20.0 g，蔗糖1.0 g，阿魏酸 6.0 mg，水100.0 mL，pH值自然。

1.2方法

1.2.1樣品制備三角瓶分別裝入樣品制備液體培養(yǎng)基 80 mL，接入供試菌株菌絲，在生化培養(yǎng)箱中25 ℃下靜置培養(yǎng)20 d。將靜置培養(yǎng)20 d后的樣品過濾，用純凈水反復多次沖洗菌絲體，用干凈濾紙吸干水分。分別稱取1.0 g黑木耳菌絲體分裝于2.5 mL的離心管中，在4 ℃下8 000 r/min冷凍離心20 min，上清液棄掉。再往2.5 mL的離心管中加入 2.0 mL、pH值6.8的Tris-HCL緩沖液和1.0 g石英砂，在冰浴下研磨，再次在4 ℃下8 000 r/min冷凍離心20 min，取上清液置于4 ℃冰箱保藏，備用。

1.2.2電泳及染色采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳法。濃縮膠濃度5.0%，分離膠濃度12.0%；電極緩沖液為Tris-Glycine系統(tǒng)，pH值8.3。上樣量20 μL，溴酚藍指示劑1滴，在樣品上加1層10%的蔗糖；4 ℃下進行電泳；濃縮膠電壓 80 V，分離膠電壓120 V，電泳4 h左右。采用α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯和堅牢藍染色，緩沖液為0.1 mol/L pH值6.2的磷酸緩沖液。電泳結束后把凝膠轉移至配好的染色液中，25 ℃恒溫條件下染色，當有褐色的酶帶出現(xiàn)時，停止染色，用超純水漂洗凝膠板。endprint

1.2.3數據記錄和分析圖像采集：將染色后的膠板平鋪放置在掃描儀掃描倉內進行分別率為600 ppi的圖片掃描。

繪制酯酶同工酶模式圖：根據電泳譜圖以酶帶顏色和寬窄的差異，可將酶帶分為4級：顏色深而且酶帶寬的一級酶帶，顏色較深而且酶帶較寬的二級酶帶，顏色較淺而且酶帶較窄的三級酶帶，顏色很淺而且酶帶窄的四級酶帶。對酶帶進行分類并繪制酯酶同工酶模式圖。

測量相對遷移率（Rf）：相對遷移率Rf=X/Y，X為點樣孔下沿到指示劑前沿的遷移距離，Y為點樣孔下沿到凝膠中酶帶的遷移距離。用直尺測量Rf時，以酶帶的中部位置為準。

酶譜之間相似性系數（S）分析：S=2Nab/（Na+Nb）。式中Nab為Rf 值相同的酶帶數，Na和Nb分別為菌株a和菌株b各自的酶帶數。當所比菌株的酶帶數相同且全部為共有時，S=1；當所比物種沒有一條共有酶帶時，S=0。

聚類分析：根據凝膠在相同遷移率的位置上是否有條帶進行分類，該位置上有酶帶記為1，無酶帶則記為0，并利用NTSYS-pc軟件進行聚類分析。

2結果與分析

2.110種黑木耳菌株的營養(yǎng)菌絲酯酶同工酶酶譜分析

在分離膠濃度為12.0%、濃縮膠濃度為5.0%的電泳條件下對供試的10種黑木耳菌株的營養(yǎng)菌絲進行酯酶同工酶電泳，得到酯酶同工酶譜圖（圖1），依據酶譜中酶帶的差異繪制酯酶同工酶模式圖（圖2）。

圖1顯示，供試10種黑木耳菌株的酯酶同工酶活性都比較高。電泳譜圖中共出現(xiàn)36條酯酶同工酶譜帶，每一菌株的酶帶在2～5條之間，大多在3～5條之間。其中，耳629、耳801都出現(xiàn)5條酯酶同工酶譜帶，耳238、耳913和國興1號出現(xiàn)4條酯酶同工酶譜帶，耳91、耳268、秦單3#、新科1號出現(xiàn)3條酯酶同工酶譜帶，秦單4#最少，只有2條同工酶譜帶。10個黑木耳菌株出現(xiàn)10個不同酶譜類型，沒有相同的酶譜類型，其中耳91和耳268、耳238和耳913菌株的帶型基本相似。10個供試菌株在Rf值0.615和0.510處都有2個共有酶帶，這可能是黑木耳菌種的特征酶帶。

圖2顯示，10種黑木耳菌株都共有1個二級酶帶，耳629、國興1號和新科1號的二級酶帶最多，有2條；耳238、耳629和耳913不具有一級酶帶，只有新科1號有2條一級酶帶。

2.210種黑木耳菌株酯酶同工酶的Rf值比較

2.310種黑木耳菌株間酶譜聚類分析

2.3.110種黑木耳菌株酯酶同工酶酶譜相似系數（S）根據酶譜之間相似性系數（S）計算10種黑木耳菌株酯酶同工酶譜相似性系數（表2）。表210種黑木耳菌株酯酶同工酶酶譜的相似系數

菌株編號相似系數耳91耳238耳268耳629耳801耳913秦單3#秦單4#國興1號新科1號耳911.000耳2380.8751.000耳2681.0000.8751.000耳6290.7500.8750.7501.000耳8010.5000.3750.5000.5001.000耳9130.8751.0000.8750.8750.3751.000秦單3#0.7500.6250.7500.5000.5000.6251.000秦單4#0.8750.7500.8750.6250.6250.7500.8751.000國興1號0.6250.7500.6250.6250.3750.7500.8750.7501.000新科1號0.7500.6250.7500.7500.7500.6250.7500.8750.6251.000

表2顯示，10種黑木耳菌株的遺傳相似性系數在 0.375～1.000 之間，2個菌株間的相似系數越小，說明2個菌株親緣關系較遠。其中，耳801和耳238、耳913、國興1號的相似程度最低，相似系數僅為0.375；耳801和耳91、耳268相似系數為0.500，表明它們的親緣關系較遠；而耳91和耳268、耳238和耳913的相似系數為1.000，說明它們可能是來自同一物種，甚至是親緣關系密切的變異類型。

2.3.2聚類分析構建10種黑木耳菌株聚類分析圖（圖3），結果表明，耳91和耳268、耳238和耳913的相似性系數大，說明它們之間親緣關系近；新科1號、秦單4#和秦單3#的

相似性系數較大，這3個菌株之間親緣關系較近；耳238和耳629的相似性較大，說明這2個菌株之間親緣關系比較近。耳801和耳238、耳913、國興1號的相似程度最低，說明耳801和耳238、耳913、國興1號的親緣關系比較遠，可作為黑木耳原生質體制備、融合及再生的優(yōu)勢菌株，這一結果可為陜南地區(qū)黑木耳的遺傳育種奠定理論基礎。

3討論

本研究選用陜南10種黑木耳主栽菌株作為供試材料，經 20 d 靜置液體培養(yǎng)后使酯酶同工酶的活性得到充分表達，通過對電泳條件進行試驗，最終確定分離膠濃度12.0%、濃縮膠濃度5.0%為電泳凝膠的最佳條件。為防止電泳過程中產生的熱量使樣品中同工酶變性失活，需將電泳槽放置在4 ℃恒溫環(huán)境下進行，確保試驗的順利和結果的準確性。

10種黑木耳菌株酯酶同工酶酶帶的差異分析表明，耳801和耳913、耳238、國興1號菌株酶譜的差異性較大，表明它們的親緣關系較遠；而耳91和耳268、耳238和耳913的酶譜具有一定的相似性，說明這4株菌中兩兩菌株之間的關系密切，這與相似性系數分析的結果一致。

酯酶同工酶既是通過基因來表達的，也是基因在分子水平上的體現(xiàn)，菌種間親緣關系的遠近可從菌株基因型的差異程度來反映。Vaughan在1968年提出種間親緣關系可以用酶譜相似度進行預判，不同菌株之間的相似系數越大，表明物種間有著較小的酶譜差異，親緣關系越近[17]，因此，對酯酶同工酶譜進行相似性系數分析是十分必要的。從酶譜相似系數表中可以看出，10種黑木耳菌株相似系數在0.375～1.000之間，相似系數達到0.625以上的菌株共7株，42對。其中耳91和耳268、耳238和耳913的相似系數為1.000，說明菌株間的遺傳差異普遍存在于10種黑木耳菌株中，耳91和耳268、耳238和耳913可能源于同一種，甚至是親緣關系更為密切的變異類型。endprint

通過對陜南主栽的10種黑木耳菌株的胞內酯酶同工酶進行垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析電泳譜圖，計算菌株間的相似性系數，得出耳801和耳238、耳913、國興1號的親緣性關系較遠，可作為原生質體制備、融合及再生的優(yōu)勢菌株，這可為陜南當地高產優(yōu)質的黑木耳品種的遺傳育種奠定理論基礎。

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