基于磷脂脂肪酸提取方法的微生物群落結(jié)構(gòu)研究

摘要：選取川西高原土壤和凋落物作為研究對象，分別取1、3、5、8、10 g土壤和0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g凋落物用于PLFA（磷脂脂肪酸）的提取。經(jīng)試驗確定，土壤和凋落物用于PLFA提取的最佳提取量分別為8 g和1.0 g，用超聲波提取替代振蕩提取，縮短了PLFA方法的提取時間。進一步分析土壤和凋落物中微生物群落結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果表明，相同環(huán)境下土壤和凋落物中大部分微生物類群的種類和含量都十分接近，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更有優(yōu)勢，厭氧菌比好養(yǎng)菌更加活躍。

關(guān)鍵詞：土壤；凋落物；PLFA（磷脂脂肪酸）；微生物群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0323-03

收稿日期：2013-10-30

基金項目：國家自然科學基金 （編號：31170916 ）；中國科學院儀器設(shè)備功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項目（編號：yg20110708）。

作者簡介：李范（1988—），男，四川自貢人，碩士研究生，主要研究方向為土壤微生物。E-mail：554063409@qq.com。

通信作者：李萍，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：wuping4535@sina.com。 土壤和凋落物中存在極其豐富的微生物，它們直接影響著土壤的結(jié)構(gòu)、肥力以及養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等，通過磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）方法可以對微生物群落進行定量分析。本研究首次采用超聲波方法提取森林土壤及凋落物中PLFA，探討各提取條件得到的PLFA含量差異，并分析森林土壤和凋落物間微生物群落結(jié)構(gòu)及其相互作用。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗土壤與凋落物均取自中國科學院茂縣山地生態(tài)系統(tǒng)定位研究站，地理坐標（31°41′N，103°53′ E），屬暖溫帶亞高山季風氣候，冬季寒冷干燥、夏季多雨，土壤pH值為5.8～60，年平均溫度為8.9 ℃，年降水量919.5 mm。取表層0～20 cm 土壤并混勻，過2 mm篩，去掉石塊植物殘根等雜物，裝入塑封袋后置于放有冰袋的泡沫箱運回實驗室，于-70 ℃保存，7 d內(nèi)完成PLFA測定。

凋落物收集于分解試驗開始前半年進行，樣方內(nèi)均勻設(shè)置凋落物收集框，框的大小為2 m（長）×2 m（寬）×20 cm（高），底部安裝有孔徑為8 mm的尼龍網(wǎng)。收集時間為1個季度，將收集到的凋落物樣品去除網(wǎng)內(nèi)雜物，將枝葉以枝與葉的重量比為1 ∶1的比例混合均勻，將收集到的凋落物放入分解袋，再將分解袋放置在采樣地表周圍，本次試驗采用的塑料網(wǎng)袋為20（長） cm×20（寬） cm、網(wǎng)眼為1 mm，并在下一季度取回，低溫保存帶回實驗室，測重后將凋落物碾碎進行磷脂脂肪酸分析。

1.2試驗方法

為了確定土壤跟凋落物中PLFA的最適提取量，土壤分別取1、3、5、8、10 g，凋落物分別取0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g用于PLFA的提取，加入足量的提取劑 （25 mL），保證不同樣品量的凋落物和土壤都能得到充分的提取，進而確定各自最佳取樣量。

為了確定提取方法對提取效率的影響，同時為了驗證超聲波提取樣品中的PLFA能否在傳統(tǒng)振蕩提取的基礎(chǔ)上用更短的時間提出PLFA，本試驗采用有機質(zhì)含量較高的黑土作為研究對象，具體方法為：第1次提取，振蕩時間設(shè)120 min，超聲時間分別設(shè)20、30、40、50、60 min，第2次提取方法與第1次提取方法相同，提取時間分別減半。用2次提取的PLFA總含量來衡量提取效率。

從-70 ℃的冰箱中取出經(jīng)冷凍干燥的土壤及掉落物，用氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液（ 體積比為1：2：0.8）作提取劑振蕩提取脂類[1]，再用100 μL 25 mg/L的C19做內(nèi)標溶解氮吹干的脂肪酸甲酯，通過帶有MIDI峰識別軟件的Agilent N6850氣相色譜進行分析。

2試驗結(jié)果

2.1土壤中PLFA含量的分析

在3 g土壤中檢測得到的單體PLFA數(shù)為24個，而在8 g土壤中則增加到了29個，10 g土壤中單體PLFA的數(shù)量比 3 g 土壤中多6個，在土壤小于8 g時，檢測到的PLFA數(shù)量隨著土壤量的增加而增加（表1）endprint

摘要：選取川西高原土壤和凋落物作為研究對象，分別取1、3、5、8、10 g土壤和0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g凋落物用于PLFA（磷脂脂肪酸）的提取。經(jīng)試驗確定，土壤和凋落物用于PLFA提取的最佳提取量分別為8 g和1.0 g，用超聲波提取替代振蕩提取，縮短了PLFA方法的提取時間。進一步分析土壤和凋落物中微生物群落結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果表明，相同環(huán)境下土壤和凋落物中大部分微生物類群的種類和含量都十分接近，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更有優(yōu)勢，厭氧菌比好養(yǎng)菌更加活躍。

關(guān)鍵詞：土壤；凋落物；PLFA（磷脂脂肪酸）；微生物群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0323-03

收稿日期：2013-10-30

基金項目：國家自然科學基金 （編號：31170916 ）；中國科學院儀器設(shè)備功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項目（編號：yg20110708）。

作者簡介：李范（1988—），男，四川自貢人，碩士研究生，主要研究方向為土壤微生物。E-mail：554063409@qq.com。

通信作者：李萍，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：wuping4535@sina.com。 土壤和凋落物中存在極其豐富的微生物，它們直接影響著土壤的結(jié)構(gòu)、肥力以及養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等，通過磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）方法可以對微生物群落進行定量分析。本研究首次采用超聲波方法提取森林土壤及凋落物中PLFA，探討各提取條件得到的PLFA含量差異，并分析森林土壤和凋落物間微生物群落結(jié)構(gòu)及其相互作用。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗土壤與凋落物均取自中國科學院茂縣山地生態(tài)系統(tǒng)定位研究站，地理坐標（31°41′N，103°53′ E），屬暖溫帶亞高山季風氣候，冬季寒冷干燥、夏季多雨，土壤pH值為5.8～60，年平均溫度為8.9 ℃，年降水量919.5 mm。取表層0～20 cm 土壤并混勻，過2 mm篩，去掉石塊植物殘根等雜物，裝入塑封袋后置于放有冰袋的泡沫箱運回實驗室，于-70 ℃保存，7 d內(nèi)完成PLFA測定。

凋落物收集于分解試驗開始前半年進行，樣方內(nèi)均勻設(shè)置凋落物收集框，框的大小為2 m（長）×2 m（寬）×20 cm（高），底部安裝有孔徑為8 mm的尼龍網(wǎng)。收集時間為1個季度，將收集到的凋落物樣品去除網(wǎng)內(nèi)雜物，將枝葉以枝與葉的重量比為1 ∶1的比例混合均勻，將收集到的凋落物放入分解袋，再將分解袋放置在采樣地表周圍，本次試驗采用的塑料網(wǎng)袋為20（長） cm×20（寬） cm、網(wǎng)眼為1 mm，并在下一季度取回，低溫保存帶回實驗室，測重后將凋落物碾碎進行磷脂脂肪酸分析。

1.2試驗方法

為了確定土壤跟凋落物中PLFA的最適提取量，土壤分別取1、3、5、8、10 g，凋落物分別取0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g用于PLFA的提取，加入足量的提取劑 （25 mL），保證不同樣品量的凋落物和土壤都能得到充分的提取，進而確定各自最佳取樣量。

為了確定提取方法對提取效率的影響，同時為了驗證超聲波提取樣品中的PLFA能否在傳統(tǒng)振蕩提取的基礎(chǔ)上用更短的時間提出PLFA，本試驗采用有機質(zhì)含量較高的黑土作為研究對象，具體方法為：第1次提取，振蕩時間設(shè)120 min，超聲時間分別設(shè)20、30、40、50、60 min，第2次提取方法與第1次提取方法相同，提取時間分別減半。用2次提取的PLFA總含量來衡量提取效率。

從-70 ℃的冰箱中取出經(jīng)冷凍干燥的土壤及掉落物，用氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液（ 體積比為1：2：0.8）作提取劑振蕩提取脂類[1]，再用100 μL 25 mg/L的C19做內(nèi)標溶解氮吹干的脂肪酸甲酯，通過帶有MIDI峰識別軟件的Agilent N6850氣相色譜進行分析。

2試驗結(jié)果

2.1土壤中PLFA含量的分析

在3 g土壤中檢測得到的單體PLFA數(shù)為24個，而在8 g土壤中則增加到了29個，10 g土壤中單體PLFA的數(shù)量比 3 g 土壤中多6個，在土壤小于8 g時，檢測到的PLFA數(shù)量隨著土壤量的增加而增加（表1）endprint

摘要：選取川西高原土壤和凋落物作為研究對象，分別取1、3、5、8、10 g土壤和0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g凋落物用于PLFA（磷脂脂肪酸）的提取。經(jīng)試驗確定，土壤和凋落物用于PLFA提取的最佳提取量分別為8 g和1.0 g，用超聲波提取替代振蕩提取，縮短了PLFA方法的提取時間。進一步分析土壤和凋落物中微生物群落結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果表明，相同環(huán)境下土壤和凋落物中大部分微生物類群的種類和含量都十分接近，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更有優(yōu)勢，厭氧菌比好養(yǎng)菌更加活躍。

關(guān)鍵詞：土壤；凋落物；PLFA（磷脂脂肪酸）；微生物群落結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0323-03

收稿日期：2013-10-30

基金項目：國家自然科學基金 （編號：31170916 ）；中國科學院儀器設(shè)備功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項目（編號：yg20110708）。

作者簡介：李范（1988—），男，四川自貢人，碩士研究生，主要研究方向為土壤微生物。E-mail：554063409@qq.com。

通信作者：李萍，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail：wuping4535@sina.com。 土壤和凋落物中存在極其豐富的微生物，它們直接影響著土壤的結(jié)構(gòu)、肥力以及養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等，通過磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）方法可以對微生物群落進行定量分析。本研究首次采用超聲波方法提取森林土壤及凋落物中PLFA，探討各提取條件得到的PLFA含量差異，并分析森林土壤和凋落物間微生物群落結(jié)構(gòu)及其相互作用。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗土壤與凋落物均取自中國科學院茂縣山地生態(tài)系統(tǒng)定位研究站，地理坐標（31°41′N，103°53′ E），屬暖溫帶亞高山季風氣候，冬季寒冷干燥、夏季多雨，土壤pH值為5.8～60，年平均溫度為8.9 ℃，年降水量919.5 mm。取表層0～20 cm 土壤并混勻，過2 mm篩，去掉石塊植物殘根等雜物，裝入塑封袋后置于放有冰袋的泡沫箱運回實驗室，于-70 ℃保存，7 d內(nèi)完成PLFA測定。

凋落物收集于分解試驗開始前半年進行，樣方內(nèi)均勻設(shè)置凋落物收集框，框的大小為2 m（長）×2 m（寬）×20 cm（高），底部安裝有孔徑為8 mm的尼龍網(wǎng)。收集時間為1個季度，將收集到的凋落物樣品去除網(wǎng)內(nèi)雜物，將枝葉以枝與葉的重量比為1 ∶1的比例混合均勻，將收集到的凋落物放入分解袋，再將分解袋放置在采樣地表周圍，本次試驗采用的塑料網(wǎng)袋為20（長） cm×20（寬） cm、網(wǎng)眼為1 mm，并在下一季度取回，低溫保存帶回實驗室，測重后將凋落物碾碎進行磷脂脂肪酸分析。

1.2試驗方法

為了確定土壤跟凋落物中PLFA的最適提取量，土壤分別取1、3、5、8、10 g，凋落物分別取0.5、0.7、0.9、1.0、1.2 g用于PLFA的提取，加入足量的提取劑 （25 mL），保證不同樣品量的凋落物和土壤都能得到充分的提取，進而確定各自最佳取樣量。

為了確定提取方法對提取效率的影響，同時為了驗證超聲波提取樣品中的PLFA能否在傳統(tǒng)振蕩提取的基礎(chǔ)上用更短的時間提出PLFA，本試驗采用有機質(zhì)含量較高的黑土作為研究對象，具體方法為：第1次提取，振蕩時間設(shè)120 min，超聲時間分別設(shè)20、30、40、50、60 min，第2次提取方法與第1次提取方法相同，提取時間分別減半。用2次提取的PLFA總含量來衡量提取效率。

從-70 ℃的冰箱中取出經(jīng)冷凍干燥的土壤及掉落物，用氯仿-甲醇-檸檬酸緩沖液（ 體積比為1：2：0.8）作提取劑振蕩提取脂類[1]，再用100 μL 25 mg/L的C19做內(nèi)標溶解氮吹干的脂肪酸甲酯，通過帶有MIDI峰識別軟件的Agilent N6850氣相色譜進行分析。

2試驗結(jié)果

2.1土壤中PLFA含量的分析

在3 g土壤中檢測得到的單體PLFA數(shù)為24個，而在8 g土壤中則增加到了29個，10 g土壤中單體PLFA的數(shù)量比 3 g 土壤中多6個，在土壤小于8 g時，檢測到的PLFA數(shù)量隨著土壤量的增加而增加（表1）endprint