17—AAG對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞株增殖和凋亡作用的影響

陳美霓+郭巍（等）

[摘要] 目的 觀察17-AAG對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響并探討其機(jī)制。 方法 四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)不同濃度的17-AAG對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響；熒光顯微鏡觀察碘化丙啶（PI）染色的細(xì)胞凋亡形態(tài)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析細(xì)胞周期分布和凋亡率的變化；免疫組化法檢測(cè)肝癌HepG2細(xì)胞中重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白（VEGF-C蛋白）表達(dá)水平變化。 結(jié)果 不同濃度的17-AAG呈時(shí)間、劑量依賴性抑制肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖（P < 0.05）；流式細(xì)胞儀分析顯示，17-AAG作用HepG2細(xì)胞48 h后G2/M期細(xì)胞比例上升，G1/G0期細(xì)胞比例下降；0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L 17-AAG作用HepG2細(xì)胞48 h后的凋亡率分別為（3.23±1.43）%、（9.71±2.20）%、（14.15±2.34）%、（23.65±2.58）%；隨著藥物濃度的加大，VEGF-C蛋白表達(dá)逐漸減少。 結(jié)論 17-AAG對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，并能抑制VEGF-C蛋白的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 熱休克蛋白90；17-AAG；肝細(xì)胞癌；MTT法

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）10（c）-0012-04

Effects of 17-AAG on proliferation and apoptosis of human hepatoma carcinoma cell lines HepG2

CHEN Meini1 GUO Wei2▲ ZHAO Jumei1 WEI Xiaoli1 WANG Aihong1 PANG Qiuxia1

1.Center of Medical Experiment， Medical College of Yan′an University， Shaanxi Province， Yan′an 716000， China； 2.Department of Urology Surgery， the Affiliated Hospital of Medical College of Yan′an University， Shaanxi Province， Yan′an 716000， China

[Abstract] Objective To study the effect of 17-allylamino-17-demethoxygelda-namycin （17-AAG） on cell proliferation and apoptosis in human hepatoma carcinoma cell lines HepG2 and analyze the possible mechanism. Methods The human hepatoma carcinoma cell lines HepG2 cells were treated with different concentrations of 17-AAG in vitro， the cell proliferation was analyzed by the MTT； the cell apoptosis changes was observed using PI dyeing under the fluorescence microscope； the effect of 17-AAG on apoptosis and cell cycle were assayed through flow cytometry； the expression of VEGF-C protein was detected by immunohistochemistry. Results 17-AAG significantly suppressed the proliferation of HepG2 cells in a time and dose-dependent manner （P < 0.05）. Flow cytometry analysis showed that 17-AAG could increase the cell population in G2/M phase and reduce the cell population in G1/G0 phase at 48 h. HepG2 cells were treated with 17-AAG of 0.63， 1.25， 2.5 and 5.0 μmol/L concentrations for 48 h， the apoptosis rate were （3.23±1.43）%， （9.71±2.20）%， （14.15±2.34）% and （23.65±2.58）%. The expression of VEGF-C protein was reduced with the increase of drug concentration. Conclusion 17-AAG can inhibit proliferation and induce apoptosis of HepG2 cells， and can decrease the expression of VEGF-C protein.

[Key words] HSP90； 17-AAG； Hepatocellular carcinoma； MTT

原發(fā)性肝細(xì)胞癌是全球第5位常見(jiàn)惡性腫瘤，其病死率占惡性腫瘤病死率的第3位。據(jù)2008年的報(bào)道，中國(guó)肝癌5年患病數(shù)為29.6萬(wàn)例，約占全球肝癌5年患病數(shù)的48.3%。在未來(lái)10年肝癌的發(fā)病數(shù)和病死數(shù)均將呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。采用手術(shù)切除等治愈方法僅適合10%～20%的肝癌患者，在5年內(nèi)復(fù)發(fā)率仍超過(guò)70%[1]。所以尋找以腫瘤細(xì)胞特性為作用靶點(diǎn)的分子靶向治療有著特別重要的意義。HSP90抑制劑17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素（17-AAG）對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，但目前尚未見(jiàn)17-AAG對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡影響的報(bào)道，本文探討17-AAG對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)周期、誘導(dǎo)凋亡及對(duì)重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白（VEGF-C）的表達(dá)進(jìn)行初步探討，為17-AAG治療肝癌的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。RPMI-1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾公司），17-AAG、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）及碘化丙啶（PI）（美國(guó)Sigma公司）AnnexinV FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD pharmingen公司），RNase A酶（德國(guó)Merck公司），胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），兔抗人VEGF-C蛋白、兔二抗及DAB顯色劑（武漢博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮保存的人肝癌HepG2細(xì)胞在37℃恒溫水浴箱中快速?gòu)?fù)蘇，接種于內(nèi)含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，加完全培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，以每孔為3×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后棄上清液，設(shè)無(wú)細(xì)胞孔作為空白組，不加藥孔為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組17-AAG濃度為0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L，每組設(shè)5個(gè)平行孔。分別溫育24、48、72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，吸凈上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm處的吸光度值，空白組調(diào)零。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.3 PI染色觀察細(xì)胞核形態(tài) 人肝癌HepG2細(xì)胞接種于內(nèi)有重鉻酸鉀處理過(guò)的蓋玻片的24孔板內(nèi)培養(yǎng)。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)48 h后終止，去上清液，用PBS洗滌3次，用50 μg/mL的PI熒光染液在4℃冰箱中避光染色20 min后，夾出蓋玻片蓋在載玻片上，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)并拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌HepG2細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，培養(yǎng)48 h后胰酶消化，用磷酸鹽緩沖液（PBS）離心洗滌2次。①細(xì)胞周期：預(yù)冷70%酒精固定，4℃過(guò)夜，離心，棄去固定液，然后加入PBS含50 μg/mL的PI，100 μg/mL RNase A酶，0.2%Triton X-100染色液，微量振蕩器上振蕩混勻，4℃避光孵育30 min，200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。②細(xì)胞凋亡：嚴(yán)格按照AnnexinV FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 VEGF-C蛋白表達(dá)的檢測(cè) 將人肝癌HepG2細(xì)胞接種于內(nèi)有蓋玻片的6孔板內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)，設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，用中性樹(shù)膠將細(xì)胞面朝上固定于載玻片上，采用免疫組化鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）法染色，胰酶抗原修復(fù)，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。兔抗人VEGF-C稀釋比例為1∶100，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒判斷為陽(yáng)性細(xì)胞，按照Fromowit等綜合計(jì)分法在高倍鏡下對(duì)染色細(xì)胞著色反應(yīng)作結(jié)果判定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析，行t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 17-AAG對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

MTT測(cè)定結(jié)果顯示，分別以0.63、1.25、2.5、5.0 μmol/L 4個(gè)濃度的17-AAG作用于人肝癌HepG2細(xì)胞24、48、72 h后，HepG2細(xì)胞均有不同程度的抑制生長(zhǎng)作用，各實(shí)驗(yàn)組增殖抑制率與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。其抑制作用經(jīng)方差分析，具有劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度的17-AAG對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率（%，x±s）

注：與對(duì)照組比較，#P < 0.05；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素

2.2 PI染色觀察凋亡細(xì)胞核形態(tài)變化

熒光顯微鏡下觀察17-AAG不同濃度組48 h后PI染色下HepG2細(xì)胞的形態(tài)變化（圖1）。鏡下細(xì)胞核呈紅色熒光，對(duì)照組HepG2細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核大小一致，著色均勻；實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)HepG2細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核固縮，呈濃縮強(qiáng)熒光，并隨藥物濃度升高，細(xì)胞數(shù)下降，凋亡小體逐漸增多。

A：對(duì)照組；B：0.63 μmol/L組；C：1.25 μmol/L組；D：2.5 μmol/L組；E：5.0 μmol/L組

圖1 熒光顯微鏡下HepG2的細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)變化

（PI熒光染色，100×）

2.3 17-AAG對(duì)HepG2細(xì)胞周期和凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，HepG2細(xì)胞在17-AAG 48 h作用下，隨藥物濃度的增加，G2/M期的細(xì)胞比例增加，提示17-AAG能使HepG2細(xì)胞阻滯在G2/M期，PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，經(jīng)17-AAG作用48 h后，不同濃度的17-AAG均能使細(xì)胞被阻滯在G2/M期。細(xì)胞周期阻滯作用亦隨藥物濃度增加而升高。肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的增加明顯高于對(duì)照組細(xì)胞，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 17-AAG對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞周期和凋亡率的影響（%，x±s）

注：與對(duì)照組比較，#P < 0.05；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)VEGF-C蛋白表達(dá)結(jié)果

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，對(duì)照組HepG2細(xì)胞VEGF-C蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，棕黃色顆粒多，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率高，見(jiàn)圖2A。17-AAG作用HepG2細(xì)胞48 h后，加藥細(xì)胞VEGF-C蛋白與對(duì)照組比較，隨著17-AAG濃度的增加，表達(dá)率及表達(dá)量呈逐漸降低趨勢(shì)。見(jiàn)圖2B～E。

A：對(duì)照組；B：0.63 μmol/L組；C：1.25 μmol/L組；D：2.5 μmol/L組；E：5.0 μmol/L組；17-AAG：17-丙烯胺基-17-去甲氧格爾德霉素；VEGF-C：重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白

圖2 17-AAG處理HepG2 48 h后VEGF-C表達(dá)的影響（400×）

3 討論

肝癌是嚴(yán)重威脅著全球人類生命健康的疾病之一。近幾年，隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入，分子靶向藥物已在多種腫瘤中進(jìn)行廣泛研究和應(yīng)用。HSP90是一種高度保守的具有特殊分子伴侶的功能蛋白。HSP90可以調(diào)節(jié)下游服務(wù)蛋白的穩(wěn)定性[2]。還參與多重信號(hào)通路的調(diào)控以及細(xì)胞周期進(jìn)程，在致癌信號(hào)的傳導(dǎo)、血管的新生、抗細(xì)胞凋亡以及腫瘤轉(zhuǎn)移等方面有著重要的作用[3]。抑制HSP90可以消耗下游服務(wù)蛋白以及影響致癌的途徑，促進(jìn)凋亡的發(fā)揮和抗腫瘤的效應(yīng)[4]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HSP90抑制劑17-AAG對(duì)白血病[5]、乳腺癌[6]、多發(fā)性骨髓瘤[7]、前列腺癌[8]等腫瘤有治療活性，并與多數(shù)細(xì)胞毒試劑、蛋白酶體抑制劑、組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑和新型靶向藥物聯(lián)用具有協(xié)同或增強(qiáng)的效果[9]。17-AAG通過(guò)與ATP特異性競(jìng)爭(zhēng)ATP/ADP位點(diǎn)，使HSP90構(gòu)象改變導(dǎo)致效應(yīng)蛋白失活，從而發(fā)揮其抑制生長(zhǎng)，促進(jìn)凋亡的作用[10]。17-AAG還可誘導(dǎo)Flt3-ITD的降解[11]，對(duì)有Flt3-ITD的突變AML患者有望改善其預(yù)后。實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果表明，HSP90抑制劑17-AAG對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)的作用，抑制作用隨著作用時(shí)間、藥物濃度的增加而增強(qiáng)。通過(guò)PI熒光染色，觀察到17-AAG作用過(guò)的HepG2細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞核著色由大小均一變成體積小而深，并出現(xiàn)凋亡小體，提示17-AAG對(duì)HepG2細(xì)胞有抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡的作用。本次試驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞流式檢測(cè)，提示17-AAG的體外抑制可能與阻滯HepG2細(xì)胞在G2/M期，并促進(jìn)凋亡有關(guān)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）具有促進(jìn)惡性腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。VEGF-C是VEGF家族中最早被發(fā)現(xiàn)的促淋巴管生成因子，與其受體VEGFR-3結(jié)合后促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，主要為三條通路：①VEGF-3胞內(nèi)的區(qū)酪氨酸Y1230/Y1231，發(fā)生自磷酸化、被識(shí)別、結(jié)合，通過(guò)誘導(dǎo)活化CRB2/ERX1/2和PI13K/AKT信號(hào)通路，啟動(dòng)DNA復(fù)制，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增生；②VEGFR-3酪氨酸殘基Y1063發(fā)生磷酸化，誘導(dǎo)活化CRKⅠ/Ⅱ和c-Jun氨基末端激酶Gnk1/2，引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的信號(hào)；③通過(guò)蛋白激酶C（PKC）依賴的p42/p44 MAPK活化途徑和PI3K/AKT磷酸化產(chǎn)生的信號(hào)[12]。VEGFR-3通過(guò)與VEGF-C結(jié)合后，還調(diào)節(jié)血管滲透性，促進(jìn)腫瘤組織進(jìn)入淋巴管，抑制凋亡，導(dǎo)致腫瘤的高轉(zhuǎn)移率的發(fā)生[13]。有研究報(bào)道HSP90抑制劑根赤殼菌素類可以抑制VEGF的表達(dá)[14]，17-AAG可以通過(guò)阻斷STAT3通路抑制胃癌和乳腺癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)[15]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，VEGF-C在人肝癌HepG2細(xì)胞對(duì)照組中處于高表達(dá)，一定劑量的17-AAG可以明顯下調(diào)VEGF-C蛋白的表達(dá)。提示VEGF-C蛋白參與了肝癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的相關(guān)生物學(xué)行為的調(diào)控，17-AAG可以通過(guò)下調(diào)VEGF-C蛋白的表達(dá)抑制淋巴管的生成，可能是17-AAG抑制肝癌的機(jī)制之一。

總之，本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HSP90抑制劑17-AAG能夠抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡，并通過(guò)下調(diào)VEGF蛋白阻礙腫瘤的侵襲。由于17-AAG發(fā)揮抗腫瘤的機(jī)制很多，還需進(jìn)一步研究，為肝癌臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2014-06-25 本文編輯：衛(wèi) 軻）

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[15] 肖麗君，趙恩宏，趙爽，等.17-AAG對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)STAT3和VEGF表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42（1）：65-68.

（收稿日期：2014-06-25 本文編輯：衛(wèi) 軻）

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（收稿日期：2014-06-25 本文編輯：衛(wèi) 軻）