王曉浪 周建華 王從俊

腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)異常增殖構(gòu)成了多種腎小球腎炎發(fā)生、發(fā)展的主要病理變化，持續(xù)的細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積聚最終將導(dǎo)致腎小球硬化或腎衰竭，并引起嚴(yán)重的腎功能障礙［1］。GMCs是腎小球內(nèi)非常活躍的固有細(xì)胞，在腎小球炎癥與硬化的發(fā)病過程中，既是主要的靶細(xì)胞，也是病變過程的主要參與者，因此控制GMCs增殖對逆轉(zhuǎn)腎小球損傷和防止其向慢性轉(zhuǎn)變有重要的意義。

IL-24主要由外周血單個核細(xì)胞、胸腺、脾臟等免疫器官和分化的黑色素細(xì)胞表達(dá)［2］，具有較明顯的抗腫瘤作用，能選擇性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長［3～5］。本研究前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí) IL-24可有效轉(zhuǎn)染進(jìn)入GMCs并穩(wěn)定表達(dá)，且對正常生長GMCs無影響［6］。本研究進(jìn)一步觀察了IL-24轉(zhuǎn)移對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的GMCs凋亡的影響，并通過研究IL-24轉(zhuǎn)移對LPS誘導(dǎo)的GMCs周期調(diào)節(jié)蛋白p21、p27及CyclinE的影響，試圖探討IL-24抑制GMCs增生的可能途徑，為臨床治療系膜增生性腎小球腎炎提供新的思路。

1 方法

1.1 細(xì)胞與腺病毒載體來源 腺病毒載體(美國Gene公司)、永生化293細(xì)胞系(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院普外科惠贈)、SV40病毒轉(zhuǎn)染后永生化的大鼠GMCs(武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心)。

1.2 試劑與儀器 新生牛血清(FBS)、DMEM、0.25%胰酶(美國Gibco公司);IL-24 ELISA試劑盒(美國R＆D公司);RT逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(Fermentas公司);CyclinE、p27兔抗鼠多克隆抗體(武漢博士德公司)、actin、p21兔抗鼠多克隆抗體(北京中杉公司)、二抗羊抗兔多克隆抗體(深圳晶美公司)、Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒(深圳晶美公司)。超凈工作臺(SW-CJ-1F型，蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司)。CO2培養(yǎng)箱(BB16/BB5060型，美國 Heraeus公司)，倒置顯微鏡(IX70型，日本Olympus公司);臺式離心機(jī)(LDZ5-2型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠);低溫高速離心機(jī)(AnantiTMJ-25型，Beckman公司);流式細(xì)胞儀(FACSCalibur型，美國BD公司)。

1.3 IL-24腺病毒載體擴(kuò)增 用10%FBS/DMEM培養(yǎng)293細(xì)胞，擴(kuò)增腺病毒載體。

1.4 GMCs的培養(yǎng) GMCs常規(guī)用含10%FBS/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～4d換液傳代1次，取4～6代細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.5 IL-24對LPS誘導(dǎo)的GMCs凋亡的影響

1.5.1 分組和腺病毒轉(zhuǎn)染 分為對照組、Ad.IL-24組、LPS組和LPS+Ad.IL-24組，其中對照組和LPS組不轉(zhuǎn)染GMCs，Ad.IL-24組和LPS+Ad.IL-24組以每細(xì)胞102個攜帶IL-24腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染GMCs。4組均取對數(shù)生長期的GMCs接種于6孔板，培養(yǎng)24h待細(xì)胞達(dá)到亞融合狀態(tài)，GMCs用維持液同步化24h后，對照組和Ad.IL-24組予5%FBS/DMEM培養(yǎng)，LPS組和LPS+Ad.IL-24組在此基礎(chǔ)上添加10mg·L-1LPS培養(yǎng)。4組分別提取培養(yǎng)24、48h的GMCs或上清備用。

1.5.2 細(xì)胞凋亡分析 各組培養(yǎng)后24和48h GMCs用預(yù)冷的PBS洗2次，胰酶消化，800 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞，PBS洗1次，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度106·mL-1，取100μL細(xì)胞懸液于流式管中加入5μL膜聯(lián)蛋白V-FITC 標(biāo)記和 10μL(20μg·mL-1)的碘化丙啶，混勻后于室溫避光15 min后采用流式細(xì)胞儀檢測，重復(fù)試驗(yàn)3次，結(jié)果采用Cell-Quest分析。

1.6 IL-24對GMCs周期蛋白的影響

1.6.1 分組和腺病毒轉(zhuǎn)染 對照組和Ad.IL-24+LPS組的處理同1.5.1項(xiàng)下，Ad-GFP組采用攜帶綠色熒光蛋白的對照載體轉(zhuǎn)染，以5%FBS/DMEM+10mg·L-1LPS培養(yǎng)。3組均取培養(yǎng)后24和48h GMCs樣本或上清備用。

1.6.2 Western-blot檢測GMCs周期蛋白 收集細(xì)胞提取抗原蛋白，行蛋白定量，用 Western-blot檢測 p21、p27及CyclinE，結(jié)果采用Gel-2000分析，按照說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 IL-24對LPS誘導(dǎo)的GMCs凋亡的影響 各組培養(yǎng)后的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果如圖1所示。GMCs在培養(yǎng)后24和48h細(xì)胞凋亡率:對照組分別為(0.86±0.15)%和(0.98±0.4)%;Ad.IL-24組分別為(1.02±0.22)%和(1.43±0.31)%;LPS組分別為(2.19±0.81)%和(2.49±0.12)%，LPS+Ad.IL-24組分別為(18.01±1.17)%和(26.82±5.01)%。4組細(xì)胞凋亡率培養(yǎng)后48h均高于24h;培養(yǎng)后2個觀察時間細(xì)胞凋亡率4組間差異均總體上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.19，(P＜0.05))，對照組與IL-24組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，LPS組顯著高于對照組(t=6.57，(P＜0.05))，LPS+Ad.IL-24組細(xì)胞凋亡率最高(t=12.43，(P＜0.05))。

圖1 IL-24對脂多糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響(Annexin V/PI雙染法)Fig 1 Effects of IL-24 on apoptosis of rat glomerular mesangial cells induced by LPS(Annexin V/PIdoubledye method)

2.2 IL-24對GMCs細(xì)胞周期蛋白的影響 Western-blot檢測p21、p27及 CyclinE的結(jié)果如圖2所示，培養(yǎng)后24和48h時點(diǎn)3個周期蛋白差別不顯著，進(jìn)行合并分析。表1顯示，Ad-GFP組GMCs負(fù)調(diào)控周期蛋白p21、p27表達(dá)顯著低于對照組((P＜0.05))，GMCs正調(diào)控蛋白CyclinE表達(dá)顯著高于對照組((P＜0.05));轉(zhuǎn)染IL-24后的Ad.IL-24+LPS組p21和p27表達(dá)較Ad-GFP組均顯著上調(diào)((P＜0.05))，CyclinE表達(dá)較Ad-GFP組下調(diào);3個周期蛋白的表達(dá)Ad.IL-24+LPS和對照組的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義((P＞0.05))。

圖2 3組腎小球系膜細(xì)胞p21、p27、CyclinE表達(dá)的Western-blot檢測結(jié)果Fig 2 Western-blot results of p21，p27 and CyclinEin 3 groups

Notes P1:Ad-GFP group vs control group;P2:Ad.IL24 group vs control group;P3:Ad.GFP group vs Ad-IL24 group

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與造血、胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、組織炎癥和免疫耐受等有密切關(guān)系，這種受細(xì)胞主動調(diào)控的死亡形式在組織的發(fā)育更新、穩(wěn)態(tài)維持和疾病防治中都起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)在腎小球腎炎患者中，腎小球中多核白細(xì)胞和GMCs有凋亡，凋亡使炎癥及增殖反應(yīng)緩解，而凋亡過程的延遲可促進(jìn)細(xì)胞增殖［7］。這也提示，凋亡是對細(xì)胞異常增生的一種矯正，是消除增生細(xì)胞的有效途徑。本研究觀察到，轉(zhuǎn)染Ad.IL-24使LPS誘導(dǎo)的GMCs凋亡率顯著增高，而對照組未觀察到明顯變化，提示IL-24轉(zhuǎn)移可促進(jìn)異常增生的GMCs凋亡，從而抑制LPS誘導(dǎo)的GMCs增殖。

細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)最終發(fā)生在細(xì)胞周期水平上，不同的生命體細(xì)胞及同一系統(tǒng)中不同細(xì)胞的細(xì)胞周期不同，一般S+G2+M期的時間變化小，而G1期時間變化較大，G1期是控制細(xì)胞生長的階段，也是細(xì)胞周期的關(guān)鍵和限速階段［8］，p21可廣泛抑制各種Cyclin-CDK復(fù)合物，故在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡中具有重要作用［9］。Marshall等［10］報(bào)道，將體外培養(yǎng)的足細(xì)胞暴露于轉(zhuǎn)化生長因子，檢測出其p21表達(dá)上調(diào)，而相應(yīng)出現(xiàn)的大量細(xì)胞凋亡，而在相同培養(yǎng)環(huán)境下的p21-/-足細(xì)胞則未發(fā)生凋亡。p27是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)的KIP家族重要成員之一，可抑制多種Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，對細(xì)胞周期進(jìn)行負(fù)調(diào)控，抑制細(xì)胞分裂和增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化和凋亡［11］。研究證實(shí)靜息期GMCs p27蛋白有高表達(dá)，而Thy1型腎炎大鼠p27表達(dá)下調(diào)，GMCs增殖越明顯則p27表達(dá)水平越低下［12］。CyclinE是參與細(xì)胞周期G1-S轉(zhuǎn)換的重要正性調(diào)節(jié)因子，在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中主要在G1晚期發(fā)揮正調(diào)控細(xì)胞周期的作用。本研究結(jié)果顯示，IL-24轉(zhuǎn)移后GMCs負(fù)調(diào)控蛋白 p27和p21表達(dá)上調(diào)，而正調(diào)控蛋白CyclinE下調(diào)，這可能是 IL-24轉(zhuǎn)移使 LPS誘導(dǎo)增生的GMCs凋亡增加的發(fā)生機(jī)制。

對于腎小球疾病的治療無論是抑制還是促進(jìn)GMCs凋亡都存在一些問題，比如GMCs異常增殖期，采用促GMCs凋亡的藥物不但會促進(jìn)增殖后GMCs的大量凋亡，并且可能會加劇正常GMCs凋亡;而在腎小球硬化晚期針對GMCs大量丟失時采用細(xì)胞凋亡抑制藥物可能會延緩病變細(xì)胞的清除。所以有選擇性和可控制性地誘導(dǎo)多余的GMCs凋亡，同時對機(jī)體的正常細(xì)胞不產(chǎn)生或產(chǎn)生較小的副作用，對于治療系膜增生性腎小球腎炎將起到重大突破作用。本文結(jié)果表明IL-24通過腺病毒載體可有效轉(zhuǎn)移進(jìn)入GMCs并穩(wěn)定表達(dá)，對正常GMCs無影響;上調(diào)p21及p27水平并下調(diào)CyclinE表達(dá)，使LPS誘導(dǎo)增生的GMCs凋亡增加，有效抑制LPS誘導(dǎo)的GMCs增生，說明腺病毒介導(dǎo)的IL-24轉(zhuǎn)移可能是治療系膜增生性腎小球腎炎的有效方法，為治療腎臟疾病提供了理論上的可能。

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