黃先菊，胡 超，蘇慧娟，楊寶成，劉翠芳

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074)

鐵棒錘，別名雪上一枝蒿、三轉(zhuǎn)半，收載于《部頒標(biāo)準(zhǔn)》(藏藥分冊(cè))［1］、《羌族醫(yī)藥》［2］，性苦、微辛，熱，有劇毒，以寧夏產(chǎn)鐵棒錘為地道產(chǎn)品，是民間常用中草藥之一.鐵棒錘的藥用部位為其干燥塊根，主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)痛、跌打瘀痛、毒熱、腫瘤等疾病的治療［3］.鐵棒錘含有烏頭堿(aconitine)、去氧烏頭堿、3-乙酰烏頭堿(3-acetylaconitine)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、華北烏頭堿(songorine)、牛七堿(napeuonine)、納派林堿、伏烏堿(flavaconition)等生物堿［4］.其中，烏頭堿類(lèi)生物堿既是藥用成分，又是毒性成分，它能刺激局部皮膚，使皮膚黏膜感覺(jué)神經(jīng)末梢呈興奮現(xiàn)象，產(chǎn)生瘙癢與灼熱感，繼以麻醉，喪失知覺(jué)［5］，故在臨床上常用于治療多種痛癥，如頭痛、脅痛、痹痛、癌痛等.

本研究旨在比較鐵棒錘的3個(gè)不同提取部位(石油醚、氯仿、正丁醇)LD50，并基于鐵棒錘的藥用成分又是毒性成分這一特性，選擇3個(gè)有效部位中毒性最大的部位通過(guò)熱板和扭體實(shí)驗(yàn)探討其對(duì)中樞性疼痛和炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用，并與鐵棒錘的整體藥效比較，初步揭示其鎮(zhèn)痛作用與毒性的關(guān)系.

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

昆明小鼠，SPF級(jí)，體重18～22 g，購(gòu)自于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SCXK(鄂)2008-0005］，飼養(yǎng)于中南民族大學(xué)藥學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房，可自由進(jìn)水進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)前12 h前開(kāi)始禁食，不禁水.

1.2 試藥和儀器

鐵棒錘干燥塊根購(gòu)自于安徽亳州，經(jīng)中南民族大學(xué)藥學(xué)院劉新橋副教授鑒定.醋酸(德國(guó)默克公司)，阿司匹林泡騰片(中國(guó)阿斯利康制藥有限公司)，嗎啡注射液(中國(guó)東北制藥集團(tuán))，乙醇、硫酸、石油醚和氯仿(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，甲醇(色譜純，TEDIA Company).

秒表、RCY-2型熱板儀(冀星實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，Ultimate3000高效液相色譜儀(戴安中國(guó)有限公司).

1.3 鐵棒錘氯仿部位的制備

將鐵棒錘塊根粉碎，稱(chēng)取適量，置于圓底燒瓶中，加入乙醇使粉末完全浸泡于乙醇中，電熱套加熱回流3次，分別為1，2，3 h，抽濾得濾液，45℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干.所得膏狀物用2%H2SO4溶解，石油醚脫脂后，以氨水調(diào)pH=9后用氯仿分2次萃取，合并氯仿部位的萃取液，旋蒸濃縮后烘干，得到鐵棒錘氯仿提取物粉末.

1.4 色譜條件

色譜柱 Thermo Scientific Syncronis C18(4.6×250 mm，5 μm)，甲醇-0.1%三乙胺梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)是240 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min.

1.5 鐵棒錘提取部位的急性毒性實(shí)驗(yàn)

按照受試樣品的不同急性毒性，分別設(shè)置氯仿部位劑量組(78.13，62.5，50，40，32，25.6，20.48 mg/kg)、石油醚部位劑量組(3000，5000，8333 mg/kg)、正丁醇部位劑量組(3000，5000，8333 mg/kg)和空白對(duì)照組，每組10只小鼠，雌雄各半.以滅菌水溶藥，按0.4 mL/25 g一次性灌胃給藥，連續(xù)觀察7 d，并記錄小鼠的中毒表觀特征，包括小鼠中毒的外觀表現(xiàn)(主要是嘔吐、腹式呼吸、怠動(dòng)和腹瀉，集中在給藥后前4 h)，和給藥后4 d內(nèi)的總死亡數(shù)，.由前者判斷小鼠的最低中毒劑量，由后者各個(gè)劑量的累積死亡量用SPSS軟件計(jì)算LD50.

1.6 熱板法實(shí)驗(yàn)

［6，8］，將小鼠放在預(yù)熱至55℃的恒溫水浴器金屬底板上，保持水溫恒定，以小鼠接觸熱板至舔后足反應(yīng)的時(shí)間(s)為該小鼠的痛閾值，選定痛閾值在5～30 s的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，超出此范圍或跳躍者棄之不用.篩選合格小鼠60只，按體重隨機(jī)分為6組，每組10只，灌胃給藥0.1 mL/10 g，包括空白對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(10 mg/kg嗎啡組)、鐵棒錘總提物20 mg/kg，鐵棒錘氯仿部位20，10，5 mg/kg組.重復(fù)3次正常痛閾測(cè)量，取平均值為該鼠給藥前痛閾值.給藥前痛閾值超過(guò)30 s或低于5 s的小鼠均淘汰.分別測(cè)定小鼠給藥后30，60，90 min的痛閾值.為避免組織損傷，如痛閾值超過(guò)60 s，即停止測(cè)試而按60 s記錄.鎮(zhèn)痛百分率=(給藥后痛域值–給藥前痛域值)/(給藥前痛域值)×100%.

1.7 小鼠扭體實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在恒溫實(shí)驗(yàn)房中進(jìn)行防止室溫較低.參考文獻(xiàn)［6，8］，避免小鼠性別差異，選取雌性昆明種小鼠70只，隨機(jī)分成7組，每組10只，灌胃給藥0.1 mL/10 g，包括空白對(duì)照組(生理鹽水)、陽(yáng)性對(duì)照組(200 mg/kg阿斯匹林)、鐵棒錘總提物20 mg/kg，鐵棒錘氯仿部位20，10，5 mg/kg.各組分別灌胃給藥30 min后，按0.1 mL/kg腹腔注射0.6%冰醋酸溶液，記錄小鼠30 min內(nèi)的扭體次數(shù)(腹部肌肉收縮同時(shí)后腿伸展為扭體一次).扭體抑制率=(空白對(duì)照組平均扭體數(shù)–給藥組平均扭體數(shù))/(空白對(duì)照組平均扭體數(shù))×100%.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 鐵棒錘氯仿部位的HPLC色譜圖

鐵棒錘氯仿部位的HPLC的色譜圖如圖1(e)所示，鐵棒錘氯仿部位含有苯甲酰烏頭堿、新烏頭堿、烏頭堿和雪上一枝蒿甲素，其中雪上一枝蒿甲素含量最高，新烏頭堿和烏頭堿含量較低.

圖1 鐵棒錘生物堿成分HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatograms of alkaloid ingredients from chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.

2.2 鐵棒錘提取部位的急性毒性

鐵棒錘各提取部位給藥中毒的表現(xiàn)包括干嘔、腹式呼吸、松毛、活動(dòng)量減少、抓嘴、出汗、流涎、便秘、眼球凸起的中毒癥狀，嚴(yán)重的致死.鐵棒錘各提取部位的急性毒性結(jié)果見(jiàn)表1，由SPSS軟件處理數(shù)據(jù)可得到鐵棒錘氯仿部位、石油醚部位、正丁醇部位3種不同活性成分的 LD50分別為 37.514，6766.928，5492.337 mg/kg.可見(jiàn)鐵棒錘不同部位對(duì)小鼠急性毒性強(qiáng)度差別較大，其中氯仿部位毒性最強(qiáng)，其次為正丁醇部位和石油醚部位.

表1 鐵棒錘不同提取部位的急性毒性Tab.1 The acute toxicity of different extracts of Aconitum Pendulum Busch.

2.3 鐵棒錘氯仿部位對(duì)熱板法小鼠痛閾值的影響

熱板法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可見(jiàn)，鐵棒錘氯仿部位各組在給藥后30，60，90 min后均能顯著提高小鼠的痛閾值，較空白組均有顯著性差異.5～20 mg/kg鐵棒錘氯仿部位呈現(xiàn)劑量依賴(lài)的鎮(zhèn)痛作用，20 mg/kg氯仿部位的鎮(zhèn)痛百分率遠(yuǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照嗎啡組(p＜0.01)，但高于同劑量的鐵棒錘總提物組(p＜0.05).可見(jiàn)在中樞性疼痛方面，20 mg/kg氯仿部位的鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于同劑量鐵棒錘的總提物，但弱于陽(yáng)性對(duì)照藥嗎啡.

表2 鐵棒錘氯仿部位對(duì)小鼠痛域的影響(D，n=10)Tab.2 The analgesic effect of chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.

表2 鐵棒錘氯仿部位對(duì)小鼠痛域的影響(D，n=10)Tab.2 The analgesic effect of chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.

與對(duì)照組比較，*p＜0.05，＊＊p＜0.01

組別 給藥前痛域值/s 給藥后痛域值/s 鎮(zhèn)痛百分率/%30 min 60 min 90 min 20 mg/kg氯仿部位 25.3±7.7 45.1±16.5＊＊ 52.8±13.7＊＊ 50.9±14.4＊＊30 min 60 min 90 min 78.3 108.7 101.2 10 mg/kg氯仿部位 13.8 ±3.1 23.7 ±14.6 25.2 ±7.7* 23.8 ±8.3 71.7 82.6 72.5 5 mg/kg氯仿部位 17.3 ±5.2 26.4 ±4.0* 28.5 ±10.6＊＊ 27.7 ±7.3* 52.6 64.7 60.1 20 mg/kg 總提物 23.0 ±4.3 38.5 ±4.3＊＊ 40.3 ±4.8＊＊ 40.1 ±5.0＊＊ 67.4 75.2 74.3 10 mg/kg 嗎 啡 15.1 ±4.8 45.2 ±12.0＊＊ 54.6 ±5.4 53.0 ±12.3＊＊ 199.3 261.6 251.0空白對(duì)照 17.6 ±5.2 18.4 ±2.7 15.2 ±4.8 19.6 ±5.4– – –

鐵棒錘氯仿部位各給藥組在給藥后30，60，90 min的時(shí)效關(guān)系見(jiàn)圖2，圖2表明鐵棒錘20，10，5 mg/kg給藥組均在約60 min鎮(zhèn)痛率最高，給藥90 min后鎮(zhèn)痛藥效減退.

圖2 鐵棒錘氯仿部位對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛的時(shí)效關(guān)系Fig.2 The time-effect relationship of analgesia of chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.in mice

2.4 鐵棒錘氯仿部位對(duì)扭體反應(yīng)的影響

鐵棒錘氯仿部位對(duì)扭體反應(yīng)的影響如表3所示，20，10，5 mg/kg鐵棒錘氯仿部位均能明顯抑制小鼠腹腔注射冰醋酸所致扭體反應(yīng)，其中鐵棒錘20，10，5 mg/kg組抑制率分別為 76.4%、33.2%、13.0%.20 mg/kg鐵棒錘氯仿部位的疼痛抑制率(76.4%)顯著高于 200 mg/kg阿司匹林組(50.5%)和同劑量的總提物組(51.0%)，p ＜0.01.可見(jiàn)在炎性疼痛方面，20 mg/kg鐵棒錘氯仿部位鎮(zhèn)痛作用最好.

表3 鐵棒錘氯仿部位對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響(D，n=10)Tab.3 The analgesic effect of chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.at writhing test

表3 鐵棒錘氯仿部位對(duì)小鼠扭體反應(yīng)的影響(D，n=10)Tab.3 The analgesic effect of chloroform extract of Aconitum Pendulum Busch.at writhing test

與對(duì)照組比較，*p＜0.05，＊＊p＜0.01

/%20 mg/kg氯仿部位 4.9 ±5.6＊＊組別 扭體次數(shù) 抑制率76.4 10 mg/kg氯仿部位 13.9 ±11.2 33.2 5 mg/kg氯仿部位 18.1 ±15.1 13.0 20 mg/kg總提物 10.2±5.7＊＊ 51.0 200 mg/kg阿司匹林 10.3±5.2＊＊ 50.5空白對(duì)照 20.8 ±8.5–

3 討論

鐵棒錘氯仿部位的LD50為37.514 mg/kg，明顯低于正丁醇部位的5492.337 mg/kg和石油醚部位的6766.928 mg/kg，說(shuō)明其為鐵棒錘主要毒性部位，由于氯仿部位中烏頭堿類(lèi)生物堿含量較高.

小鼠扭體法和熱板法均為篩選藥物鎮(zhèn)痛作用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法［7］.分別適用于針對(duì)炎性疼痛和中樞性疼痛的藥物篩選.本文以民族藥鐵棒錘為研究對(duì)象，分別用熱板法和扭體法考察了不同劑量的鐵棒錘氯仿提取物的鎮(zhèn)痛作用.結(jié)果表明:熱板實(shí)驗(yàn)中不同劑量的鐵棒錘氯仿部位均能顯著提高小鼠的痛域值，其鎮(zhèn)痛效果弱于陽(yáng)性對(duì)照藥嗎啡，但強(qiáng)于同劑量的鐵棒錘總提物.扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同劑量的鐵棒錘氯仿部位均能顯著抑制腹腔注射醋酸所致的小鼠扭體反應(yīng)，顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥阿司匹林組和同劑量的鐵棒錘總提物，說(shuō)明鐵棒錘氯仿部位具有顯著的鎮(zhèn)痛活性，效果優(yōu)于阿司匹林，對(duì)炎性疼痛的療效強(qiáng)于中樞性疼痛.

20 mg/kg鐵棒錘氯仿部位的中樞性和炎性鎮(zhèn)痛作用均明顯優(yōu)于同劑量的鐵棒錘總提取物［8］.因其純化后鎮(zhèn)痛效力增強(qiáng)，或其為鎮(zhèn)痛和毒性作用的主要活性部位，故該部位的鎮(zhèn)痛作用與其毒性存在一定的關(guān)聯(lián).

鐵棒錘屬于烏頭類(lèi)中藥，其主要成分是二萜類(lèi)雙酯型生物堿，如烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿等［9］.雖然其烏頭堿類(lèi)生物堿的含量一般均小于1%，但其毒性很高，烏頭堿、中烏頭堿、次烏頭堿小鼠經(jīng)口 LD50分別為1.8，1.9，5.8 mg/kg［10］;人口服烏頭堿0.12 mg即可中毒，3～5 mg可使人致死.故鐵棒錘等烏頭類(lèi)中藥具有很好的藥用價(jià)值，但也具有一定的毒性，需要進(jìn)一步研究如何降低其毒性和增強(qiáng)其療效.

參考文獻(xiàn)

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB-WS3-1995中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)——藏藥［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1995.

［2］張 藝，鐘國(guó)躍.羌族醫(yī)藥［M］.北京:中國(guó)文史出版社，2005.

［3］閻文玖，陳德昌，高艷珍，等.伏毛鐵棒錘的研究［J］.中草藥，1983，14(9):32-36.

［4］孫文基，沙振方，王艾興，等.鐵棒錘化學(xué)成分研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1989，24(1):71-74.

［5］胡君茹，姜 華.藏藥鐵棒錘的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.甘肅中醫(yī)，2006，19(11):18-19.

［6］徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué).4版［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:700-714.

［7］陳建雙，亢 炎，佟繼銘.赤雹果總有機(jī)酸鎮(zhèn)痛作用研究［J］.江蘇中醫(yī)藥.2011，43(11):84-85.

［8］Ren Wei，Yuan Lin，Li Jun，et al.Ethanolic extract of Aconiti Brachypodi Radix attenuates nociceptive pain probably via inhibition of voltage-dependent Na+channel［J］.Afr J Tradit Complement Altern Med，2012，9(4):574-583.

［9］李婭萍，田頌九，王國(guó)榮.烏頭類(lèi)藥物的化學(xué)成分及分析方法概況［J］.中國(guó)中藥雜志，2001，26(10):659-662.

［10］黃泰康.常用中藥成分與藥理手冊(cè)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1994:821-928.