高連軍，孫迎春，李建軍，白帆，李鵬錕

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴(yán)重創(chuàng)傷。最新的流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，亞洲人脊髓損傷發(fā)病率已從12.06/100萬(wàn)上升到61.6/100萬(wàn)，平均年齡從26.8歲上升到56.6歲，并且有逐年上升的趨勢(shì)[1]。

脊髓損傷修復(fù)的研究已成為目前康復(fù)研究的重點(diǎn)。但迄今為止，還未出現(xiàn)有效的臨床治療方法。1994年，Basser等首次在傳統(tǒng)的磁共振成像中應(yīng)用彌散張量成像(diffusion tensor imaging,DTI)[2-3]。DTI通過(guò)測(cè)量組織的部分各向異性值(fractional anisotropy,FA)，可在三維空間內(nèi)定量分析組織水分子的彌散能力[4-5]，是一項(xiàng)可以在體研究中樞神經(jīng)白質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)的新技術(shù)[6]，較磁共振彌散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging,DWI)更能準(zhǔn)確地反映組織內(nèi)水分子的彌散情況，可以清楚顯示腦與脊髓的細(xì)微病理生理變化以及白質(zhì)纖維束的走行、連接和細(xì)微變化[7]。利用DTI所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行大腦或者脊髓白質(zhì)纖維束成像，即為彌散張量纖維束成像(diffusion tensor tractography,DTT)[4]。

電針刺激對(duì)受損脊髓修復(fù)有正向促進(jìn)作用[8]。孫迎春等對(duì)電針刺激脊髓損傷大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，頭針加體針治療組的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)評(píng)分優(yōu)于單純頭針或單純體針治療組，尤其是從第4周開(kāi)始，頭針加體針治療組的BBB評(píng)分明顯增高[9]。截止目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于電針治療對(duì)脊髓損傷后大鼠DTT影響的研究很少，并且沒(méi)有相關(guān)脊髓損傷后電針介入治療時(shí)間的研究。本研究欲探討不同時(shí)間進(jìn)行電針刺激治療對(duì)促進(jìn)脊髓神經(jīng)修復(fù)的效果及其對(duì)DTT中FA均值的影響，探討DTI及DTT技術(shù)在評(píng)估脊髓損傷大鼠神經(jīng)修復(fù)中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

90只健康清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(220±20)g(中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

造模成功后，用隨機(jī)數(shù)字表法將90只大鼠分為實(shí)驗(yàn)組(n=60)和對(duì)照組(n=30)，實(shí)驗(yàn)組又分為實(shí)驗(yàn)1組(n=30)和實(shí)驗(yàn)2組(n=30)。本篇論文所用數(shù)據(jù)是實(shí)驗(yàn)中的部分?jǐn)?shù)據(jù)(n=16)。

1.2 模型制備

大鼠腹腔內(nèi)注射2%戊巴比妥鈉35 mg/kg，待麻醉生效后，手術(shù)區(qū)備皮，消毒，以T10為中心切開(kāi)皮膚及皮下組織，暴露T9、T10棘突及椎板，咬除T9～T10棘突、T10椎板，運(yùn)用NYU打擊器以25 g·cm勢(shì)能(10 g×25 mm)撞擊脊髓，撞擊后迅速移開(kāi)撞擊桿。此時(shí)大鼠雙側(cè)后肢及尾部痙攣性抽搐數(shù)次后軟癱。用生理鹽水沖洗后在受損的脊髓上放一小塊脂肪組織，逐層縫合。切口消毒，立即在背部皮下注射青霉素注射液4×105U和生理鹽水20 ml，連續(xù)注射3 d。注射后將大鼠置于保溫箱內(nèi)24 h后轉(zhuǎn)入單籠飼養(yǎng)。術(shù)后每天進(jìn)行4次人工排尿，直至自主排尿建立。

1.3 干預(yù)方法

實(shí)驗(yàn)組接受頭針和體針電刺激。實(shí)驗(yàn)1組3 d時(shí)開(kāi)始電針刺激，實(shí)驗(yàn)2組2周時(shí)開(kāi)始電針刺激。對(duì)照組不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.3.1 頭針 取穴：運(yùn)動(dòng)區(qū)頭皮表面投影區(qū)上2/5(頂骨正中斜刺向耳前方)。

將大鼠置于固定器內(nèi)，待大鼠安靜20 min后，針刺運(yùn)動(dòng)區(qū)頭皮表面投影區(qū)上2/5，設(shè)定捻針儀每分鐘捻轉(zhuǎn)200轉(zhuǎn)；每次捻針3 min。接通電針治療儀，正極和負(fù)極接運(yùn)動(dòng)區(qū)左右針尾，選疏密波2 Hz，刺激強(qiáng)度以大鼠后肢輕微顫動(dòng)為度，每次通電20 min。每天1次，共10次。

1.3.2 體針 取穴：雙側(cè)肝俞穴(T9下兩旁肋間)、脾俞穴(T12下兩旁肋間)、環(huán)跳穴(后肢髖關(guān)節(jié)后上緣)、后三里穴(膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下5 mm處)。

將大鼠置于固定器內(nèi)，待大鼠安靜20 min后，針刺雙側(cè)肝俞穴、脾俞穴、環(huán)跳穴、后三里穴，設(shè)定捻針儀每分鐘捻轉(zhuǎn)200轉(zhuǎn)；每次捻針3 min。接通電針治療儀，正極接肝俞穴，負(fù)極接脾俞穴，正極接環(huán)跳穴，負(fù)極接后三里穴，選疏密波2 Hz，刺激強(qiáng)度以大鼠后肢輕微顫動(dòng)為度，每次通電20 min。每天1次，共10次。

1.4 BBB評(píng)分

在安靜的環(huán)境，將大鼠置于2×2×0.5 m的BBB評(píng)定裝置里，在4 min內(nèi)觀察記錄動(dòng)物后肢的行走及肢體活動(dòng)情況。

評(píng)分包括3個(gè)部分：第一部分評(píng)判動(dòng)物后肢各關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)及活動(dòng)度；第二部分評(píng)判后肢的步態(tài)及前后肢協(xié)調(diào)功能；第三部分評(píng)判運(yùn)動(dòng)中足、趾及尾巴的精細(xì)動(dòng)作。滿分為21分[10]。

本實(shí)驗(yàn)由對(duì)分組情況不知情的專門評(píng)價(jià)人員對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行評(píng)價(jià)。分別于SCI后1、2、4周分別由兩名專門評(píng)價(jià)人員按照BBB評(píng)分法[10]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行獨(dú)立評(píng)分，左右側(cè)下肢評(píng)分不相同時(shí)分別記錄獲取數(shù)值，每只大鼠的功能得分取兩人評(píng)分均值。

1.5 DTT/DTI掃描

采用Bruker ClinScan 7.0 T超導(dǎo)型磁共振掃描系統(tǒng)(西門子公司)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別于造模后2～4 h、術(shù)后3 d和治療后4周進(jìn)行矢狀面和橫斷面T2WI成像及橫軸面DTI成像。DTI檢查與常規(guī)橫軸面掃描定位相同。DTI掃描采用單次激發(fā)自旋回波平面回波成像序列(echo-planar imaging,EPI)，TR 5000 ms，TE 35 ms，顯示野36×30，掃描時(shí)間225 s，層厚0.8 mm，彌散加權(quán)系數(shù)b值600 s/mm2，彌散敏感梯度20個(gè)方向，掃描2次，層距為層厚的30%，矩陣128×128，層數(shù)覆蓋損傷區(qū)域。數(shù)據(jù)處理利用syngoMRB15圖像后處理軟件(西門子公司)。

由動(dòng)物核磁室專業(yè)醫(yī)師(非實(shí)驗(yàn)組人員)按照實(shí)驗(yàn)要求對(duì)每只實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行DTI和DTT掃描，獲取數(shù)據(jù)，并進(jìn)行圖像處理。由統(tǒng)計(jì)人員按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有的測(cè)量結(jié)果均以表示，BBB評(píng)分和FA均值各組不同時(shí)間點(diǎn)觀測(cè)的結(jié)果均用單因素方差分析，兩兩比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠后肢BBB評(píng)分

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在第1周時(shí)各組間BBB評(píng)分無(wú)顯著性差異(P>0.05)。第4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組BBB評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。在第2周和第4周，實(shí)驗(yàn)1組顯著高于實(shí)驗(yàn)2組(P<0.001)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能BBB評(píng)分

2.2 大鼠對(duì)應(yīng)脊髓節(jié)段FA均值

本實(shí)驗(yàn)所得FA信號(hào)均值(FA均值)與FA值呈正相關(guān)，并可以反映FA值的變化。在2～4 h和3 d時(shí)各組FA均值無(wú)顯著性差異(P>0.05)。在第4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，且實(shí)驗(yàn)1組高于實(shí)驗(yàn)2組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各不同組間大鼠對(duì)應(yīng)脊髓節(jié)段FA均值比較

2.3 在相同時(shí)間節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)脊髓節(jié)段DTT

圖1～圖6是分別代表各組傷后2～4 h和4周的DTT。圖中的顏色代表特征向量運(yùn)動(dòng)方向的變化。具體如下：藍(lán)色代表上下方向，紅色代表左右方向，綠色代表前后方向[11]。從圖中可以看出在脊髓損傷后2～4 h內(nèi)，因?yàn)榧顾枥w維束的斷裂導(dǎo)致脊髓纖維束內(nèi)各個(gè)方向的分子彌散運(yùn)動(dòng)而呈現(xiàn)出不均勻的紅色和綠色，提示大鼠脊髓纖維束的損傷。

從后視(P位)圖中可以看到：各組第4周的脊髓纖維束較傷后均有不同程度的修復(fù)，其中實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯好轉(zhuǎn)(白箭頭)。體現(xiàn)在：①脊髓纖維束神經(jīng)纖維數(shù)目增多；②脊髓纖維束均質(zhì)性變好(水分子在脊髓纖維束上下運(yùn)動(dòng)呈現(xiàn)出均勻藍(lán)色)。

圖1 實(shí)驗(yàn)1組傷后2～4 h的DTT

圖2 實(shí)驗(yàn)1組傷后4周的DTT

圖3 實(shí)驗(yàn)2組傷后2～4 h的DTT

圖4 實(shí)驗(yàn)2組傷后4周的DTT

圖5 對(duì)照組傷后2～4 h的DTT

圖6 對(duì)照組傷后4周的DTT

3 討論

脊髓損傷后，盡可能減少早期病理?yè)p害，降低繼發(fā)損傷，提高殘留神經(jīng)纖維存活是減輕和治療脊髓損傷的關(guān)鍵。而受損神經(jīng)元的修復(fù)和再生與神經(jīng)纖維的生存微環(huán)境等多種因素相關(guān)。有研究報(bào)道，電針刺激能夠促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)活性物質(zhì)的表達(dá)與神經(jīng)的再生與修復(fù)，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究[12]。

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在第1周時(shí)各組間BBB評(píng)分無(wú)顯著性差異，說(shuō)明脊髓損傷后1周內(nèi)針灸治療對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能恢復(fù)無(wú)明顯影響。這與其他研究一致。分析這可能與早期脊髓損傷后大鼠脊髓水腫炎癥持續(xù)存在有關(guān)[13]。

電針后，各實(shí)驗(yàn)組BBB評(píng)分顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，說(shuō)明各種電刺激(針灸)對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能恢復(fù)在2周后能夠出現(xiàn)改善，并且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，有積極的治療作用。推測(cè)其機(jī)理可能與針刺能明顯地減輕和延緩傷后早期病理?yè)p害，擴(kuò)張血管，改善血管舒縮功能，并且在缺血或再灌期間能進(jìn)一步上調(diào)活性生長(zhǎng)因子的免疫活性表達(dá)[14]，使組織間神經(jīng)纖維間的水腫減輕、神經(jīng)保護(hù)活性因子表達(dá)增強(qiáng)等相關(guān)。

在相同時(shí)間節(jié)點(diǎn)(第2周和第4周)，實(shí)驗(yàn)1組BBB評(píng)分顯著高于實(shí)驗(yàn)2組(P<0.001)。提示電針刺激對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能恢復(fù)越早期開(kāi)始治療，效果越明顯。有研究發(fā)現(xiàn)，電針治療急性脊髓損傷大鼠的最佳治療時(shí)間為損傷后2 h，并認(rèn)為脊髓損傷后，電針治療應(yīng)及早介入[15]。這與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論一致。

彌散(diffusion)是指分子的隨機(jī)不規(guī)則運(yùn)動(dòng)，又稱布朗運(yùn)動(dòng)(Brownian motion)。FA反映分子在空間位移的程度，且與組織的方向有關(guān)，是水分子各向異性成分占整個(gè)彌散張量的比例。其變化范圍為0～1[5]。雖然反映各向異性的參數(shù)有很多，但目前臨床上，應(yīng)用較多的是FA值。但是FA值也有其臨床局限性，體現(xiàn)在以下方面：①當(dāng)各本征值同比例改變的時(shí)候，F(xiàn)A保持不變；②FA值測(cè)量具有部位敏感性[16]。

本實(shí)驗(yàn)所得FA均值與FA值呈正相關(guān)，并可以反映FA值的變化。在2～4 h和3 d時(shí)間點(diǎn)各組FA均值無(wú)顯著性差異(P>0.05)。第4周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，而且實(shí)驗(yàn)1組高于實(shí)驗(yàn)2組(P<0.05)。從FA均值變化趨勢(shì)可以看出，F(xiàn)A值的變化也呈現(xiàn)出一個(gè)先升高后下降的過(guò)程。

脊髓損傷初發(fā)時(shí)FA值增高，可能與細(xì)胞毒性水腫、髓鞘纖維腫脹導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性減低、細(xì)胞外間隙迂曲減小有關(guān)。之后，F(xiàn)A值降低，則與結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致脊髓纖維組織的完整性及方向性喪失、血管源性水腫致細(xì)胞外間隙擴(kuò)大、局部細(xì)胞外水腫和/或纖維束中斷、減少有關(guān)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，髓鞘和神經(jīng)纖維撕裂、細(xì)胞外水腫導(dǎo)致Wallerian變性、脫髓鞘改變可能使FA值減低[18]。

在第4周時(shí)間點(diǎn)上各組之間有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組FA均值顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，提示針灸在一定程度上減少了脊髓損傷后各種病理改變；實(shí)驗(yàn)1組較實(shí)驗(yàn)2組FA均值也有提高(P<0.05)，說(shuō)明早期介入針灸治療可以最大化的減少脊髓損傷后的繼發(fā)損傷。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，傷后FA均值因?yàn)槔^發(fā)損傷、脫髓鞘改變而降低，針灸在一定程度上減緩此過(guò)程，并且早期介入針灸治療，恢復(fù)效果好。本實(shí)驗(yàn)在一定程度上可以認(rèn)為FA均值可以替代FA值來(lái)評(píng)價(jià)大鼠脊髓損傷的修復(fù)程度，并且可較敏感地反映脊髓神經(jīng)修復(fù)的變化。

由于DTT是近年來(lái)在DWI基礎(chǔ)上迅速發(fā)展起來(lái)的磁共振成像新技術(shù)，其名稱尚欠統(tǒng)一。例如有稱為纖維跟蹤技術(shù)(fiber tracking)[4]或白質(zhì)纖維束成像(tractography)[19]等。脊髓纖維束彌散張量成像的原理是利用主要特征向量的數(shù)據(jù)映射為顏色而成圖。一般用顏色來(lái)表示纖維束走形方向的變化：藍(lán)色代表上下方向，紅色代表左右方向，綠色代表前后方向[11]。

本實(shí)驗(yàn)中利用這一原理合成DTT。在脊髓受損傷后，因?yàn)槔w維束的斷裂導(dǎo)致纖維束走形方向的改變，DTT根據(jù)分子沿著斷裂脊髓纖維束的不同方向進(jìn)行彌散運(yùn)動(dòng)而呈現(xiàn)出不同顏色的改變，從而在成像上清晰地顯示出脊髓纖維束的損傷情況。脊髓纖維束的修復(fù)體現(xiàn)在以下方面：①脊髓纖維束神經(jīng)纖維數(shù)目增多；②脊髓纖維束均質(zhì)性變好(水分子在脊髓纖維束上下運(yùn)動(dòng)呈現(xiàn)出均勻藍(lán)色)。

本實(shí)驗(yàn)中無(wú)論實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組，4周后DTT都顯示出纖維束有不同程度的修復(fù)，而且實(shí)驗(yàn)組修復(fù)程度明顯好于對(duì)照組。4周后實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組DTT雖然提示纖維束走形和密度都好于損傷后2～4 h，但是并不能顯示出修復(fù)程度上的明顯區(qū)別。分析原因可能與以下方面相關(guān)：①由于臨近組織的影響以及DTI對(duì)磁場(chǎng)不均勻高度敏感[20]等原因，重建的脊髓纖維束圖像長(zhǎng)短粗細(xì)不均，且無(wú)法顯示全長(zhǎng)圖像；②我們選取的是P位圖即后視圖，在一定程度上增加了分析的難度。

本研究是應(yīng)用于大鼠脊髓損傷DTT的前期研究，有很多局限和不足，期待隨后的研究能對(duì)在DTT成像參數(shù)和評(píng)估纖維束修復(fù)程度上有所改進(jìn)。

雖然本研究是國(guó)內(nèi)DTI與DTT技術(shù)應(yīng)用與評(píng)價(jià)大鼠脊髓損傷模型的前期探索，已顯示出其獨(dú)特的效果和優(yōu)越的價(jià)值，為下一步的大鼠脊髓損傷基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中的神經(jīng)修復(fù)功能評(píng)價(jià)上提供更重要的參考價(jià)值。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，頭體針電刺激對(duì)脊髓損傷后神經(jīng)軸突再生或修復(fù)的影響顯著。并探索性地研究了電針刺激介入的時(shí)間，用FA均值的改變來(lái)描述和分析脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)情況。從本實(shí)驗(yàn)涉及的不同時(shí)間進(jìn)行電針刺激治療的結(jié)果顯示，傷后電針3 d時(shí)的治療效果顯著好于2周時(shí)的治療效果，提示在臨床治療中針灸治療早期介入效果好。

由于入組大鼠和時(shí)間點(diǎn)選取較少，可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，有待后期更早期并更密集時(shí)間點(diǎn)的大型實(shí)驗(yàn)研究。

DTT是一種評(píng)估脊髓損傷大鼠模型的新型無(wú)創(chuàng)影像學(xué)手段。本實(shí)驗(yàn)用其驗(yàn)證了FA均值在臨床和基礎(chǔ)研究應(yīng)用中的意義，但是DTT也有一定的局限性。DTT技術(shù)的應(yīng)用對(duì)脊髓損傷大鼠模型神經(jīng)纖維束的修復(fù)提供了更直觀的參考數(shù)據(jù)(FA均值)，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察提供很好的方法。

電針刺激對(duì)促進(jìn)神經(jīng)再生與修復(fù)的作用是顯著的，對(duì)脊髓損傷的治療作用是積極的，而且早期介入效果好。對(duì)脊髓損傷大鼠模型電針最佳的介入治療時(shí)間仍有待研究發(fā)現(xiàn)。

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