阮崢，王文天，楊洋，段永娟，胡曉

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 血液學(xué)研究所血液病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020

慢病毒基因表達(dá)系統(tǒng)是目前廣泛使用的基因操作工具。該表達(dá)系統(tǒng)由用于表達(dá)特定基因的目的質(zhì)粒及病毒gag/pol、Rev和VSVG等組分的包裝質(zhì)粒組成，其中包裝質(zhì)粒提供了病毒基因組mRNA 包裝成完整毒粒所必需的結(jié)構(gòu)蛋白、聚合酶和包膜蛋白。獲得高滴度的病毒是后期開展基因功能研究的關(guān)鍵。在實(shí)際工作中，研究人員大多采用商業(yè)化的慢病毒包裝產(chǎn)品，或僅將各個(gè)包裝質(zhì)粒進(jìn)行簡單混合，通常難以獲得針對(duì)所研究目的基因的最優(yōu)化的病毒包裝效率。Kumar 等[1]系統(tǒng)研究了不同慢病毒載體質(zhì)粒的包裝能力，發(fā)現(xiàn)隨著插入片段的延長，病毒滴度呈半對(duì)數(shù)形式下降，目的質(zhì)粒愈長則包裝活力毒粒的能力愈下降。當(dāng)研究的目的基因較大時(shí)，選擇優(yōu)化后的病毒包裝體系才可能得到高效率的病毒毒粒。然而，針對(duì)病毒包裝體系各組分以獲得高效病毒的研究尚為欠缺。我們利用目前廣泛應(yīng)用的三質(zhì)粒包裝體系，對(duì)慢病毒包裝時(shí)目的質(zhì)粒及各包裝質(zhì)粒的比例進(jìn)行多個(gè)條件的包裝效率比較研究，初步分析了慢病毒包裝各組分的作用意義，著重比較了Rev表達(dá)質(zhì)粒對(duì)提高包裝病毒效率的作用，以期建立高效的可用于多種細(xì)胞感染的慢病毒包裝系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 材料

293T 細(xì)胞與K562 細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫提供（購自ATCC）；感受態(tài)大腸桿菌DH5α購自TIANGEN 公司；慢病毒包裝的目的質(zhì)粒pLVXEF1a-GFP-N1（pHEGP）購 自TaKaRa Clontech 公司；病毒包裝質(zhì)粒pLP1-gag/pol、pLP2-Rev和pLPVSVG購自Invitrogen公司。

IMDM、DMEM、OPTI-MEM 低血清培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清（FBS）和0.25%胰酶-EDTA 購自Gibco 公司；LipofectAMINE 2000 購自Invitrogen 公司；polybrene 購自Sigma 公司；質(zhì)粒提取試劑盒為QIAGEN Plasmid Mini Kit 及Maxi Kit；超速離心管購自Nalgene 公司；0.45μm 濾器購自Millipore 公司；低溫超高速離心機(jī)為Beckman Coulter 公司的Avanti J-30I；數(shù)字化分析型流式細(xì)胞儀為BD公司的LSRII。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒制備

293T 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)經(jīng)0.25%胰酶-EDTA 消化傳代培養(yǎng)；K562 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 的IMDM培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48～72 h 離心換液。復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)室保藏的pLVX-EF1a-GFP-N1（pHEGP）、pLP1、pLP2和pLP-VSVG等5 株大腸桿菌DH5α，振蕩培養(yǎng)過夜后用QIAGEN 大提試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)測序驗(yàn)證正確。

1.3 慢病毒包裝

慢病毒包裝系統(tǒng)由目的質(zhì)粒、pLP1、pLP2和pLP-VSVG共4 種質(zhì)粒按一定比例組成，考慮到細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染存在飽和度，因此在控制總質(zhì)粒量不變的原則下（10μg/60 mm 中皿），同時(shí)改變2 個(gè)變量，考察2 個(gè)變量間的比例關(guān)系及重要性。混合質(zhì)粒通過脂質(zhì)體（LipofectAMINE 2000）轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，48 h 后收取含病毒粒子的上清，離心、過濾后置于4℃或-80℃保存。

1.4 病毒感染293T及K562細(xì)胞

感染前一天于6 孔板中接種5×105的293T 或K562 細(xì)胞，感染時(shí)加入1 mL 病毒上清（對(duì)照組為1 mL PBS）、1 mL DMEM 或IMDM 完全培養(yǎng)基及終濃度為8μg/mL 的polybrene，加入病毒后12 h 換液，3 d 后熒光鏡檢觀察GFP 熒光，并用流式細(xì)胞分析儀檢測GFP+細(xì)胞百分率，計(jì)算病毒感染陽性率。

2 結(jié)果

2.1 目的質(zhì)粒量是影響病毒包裝效率的首要因素

以采用不同質(zhì)粒比例進(jìn)行病毒包裝獲得的病毒上清感染293T 細(xì)胞，由于目的質(zhì)粒表達(dá)GFP 熒光蛋白，因此感染后GFP 細(xì)胞陽性率可用于反映病毒的感染率差異。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，不同條件獲得的病毒上清感染293T 細(xì)胞的GFP 陽性率最低組僅11.5%，最高組可達(dá)66.8%，說明改變質(zhì)粒比例會(huì)顯著影響病毒包裝效率。

首先分析目的質(zhì)粒pHEGP與其余3個(gè)包裝質(zhì)粒對(duì)病毒包裝效率的影響。當(dāng)pLP1-gag/pol和pLPVSVG質(zhì)粒均為2.5μg 時(shí)，3.5μg pHEGP、1.5μg pLP2-Rev組比1.5μg pHEGP、3.5μg pLP2-Rev組細(xì)胞的陽性率提高到約3 倍（圖1）。在pHEGP 與pLP1-gag/pol以 及pHEGP 與pLP-VSVG的比較 中，同樣發(fā)現(xiàn)提高目的質(zhì)粒量同時(shí)遞減某一包裝質(zhì)粒量可顯著提升GFP 陽性率（數(shù)據(jù)未示）。以上結(jié)果說明，與幾個(gè)包裝質(zhì)粒相比較，目的質(zhì)粒的量是影響病毒包裝效率的首要因素。

2.2 不同包裝質(zhì)粒的重要性有差異，pLP2-Rev是影響病毒滴度的關(guān)鍵因素

明確目的質(zhì)粒量對(duì)病毒包裝效率的決定性地位后，進(jìn)一步分析3 個(gè)包裝質(zhì)粒之間的重要性。將目的質(zhì)粒pHEGP 固定為3.5μg、3 個(gè)包裝質(zhì)?？偭慷?.5μg，分別依次提供低劑量（1.5μg）Rev、gag/pol和VSVG。當(dāng)提供低劑量VSVG質(zhì)粒時(shí)，病毒感染293T 細(xì)胞的GFP 細(xì)胞陽性率為66.8%；提供低劑量Rev質(zhì)粒時(shí)，GFP 細(xì)胞陽性率低至45.1%；提供低劑量gag/pol質(zhì)粒時(shí)，GFP 細(xì)胞陽性率居中為54.9%（圖2A）。說明Rev質(zhì)粒量對(duì)高效病毒包裝具有至關(guān)重要的作用。降低Rev劑量導(dǎo)致病毒包裝效率下降最為顯著，而減少VSVG用量仍可高效包裝病毒。將gag/pol和Rev與VSVG劑量間的相互作用進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用低劑量VSVG時(shí)，增加Rev相對(duì)含量較增加gag/pol含量能更好地提升病毒滴度（圖2B）。

2.3 白血病細(xì)胞系K562 中再現(xiàn)包裝病毒的感染效率差異

圖1 比較目的質(zhì)粒量對(duì)病毒包裝效率的影響

血液細(xì)胞及干細(xì)胞通常較貼壁細(xì)胞的病毒感染效率低，因此對(duì)病毒的滴度更為敏感?；诓捎觅N壁的293T 細(xì)胞感染篩選優(yōu)化的病毒包裝條件，我們進(jìn)一步利用白血病細(xì)胞系K562 細(xì)胞考察不同條件包裝病毒的感染效率。由流式細(xì)胞分析GFP陽性細(xì)胞的結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖3），采用不同質(zhì)粒比例包裝的病毒在K562細(xì)胞中同樣導(dǎo)致差異的病毒感染率，并且分別改變Rev、gag/pol和VSVG表達(dá)質(zhì)粒的劑量均可取得與感染293T細(xì)胞相同趨勢(shì)的結(jié)果。

圖2 各包裝質(zhì)粒量對(duì)病毒包裝效率的影響

圖3 比較不同包裝條件獲得的病毒感染紅白血病惡性細(xì)胞系K562細(xì)胞的結(jié)果

表1 第三代慢病毒包裝系統(tǒng)用于不同研究中的質(zhì)粒比例

3 討論

基于HIV的慢病毒載體系已成為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中研究基因功能的主流方法，但目前國內(nèi)外學(xué)者采用包裝系統(tǒng)中的質(zhì)粒比例卻不盡相同（表1）。大部分研究者在工作中僅采用商業(yè)化質(zhì)?；蚝唵伪壤旌希形磳?duì)慢病毒包裝系統(tǒng)各成分進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，尤其是并未意識(shí)到pLP2-Rev的比例在病毒滴度提升中的重要性，因此本研究工作具有現(xiàn)實(shí)意義。

本研究表明目的質(zhì)粒量是影響病毒滴度的決定條件，并首次發(fā)現(xiàn)Rev 蛋白是影響有效毒粒的關(guān)鍵因素。Cochrane 等發(fā)現(xiàn)Rev 蛋白與病毒基因組mRNA上的特定序列RRE（Rev response element）元件結(jié)合形成穩(wěn)定的Rev-RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對(duì)于基因組mRNA 的出核運(yùn)輸具有關(guān)鍵作用[11]。該結(jié)合位點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致Rev-RNA 結(jié)構(gòu)異常，進(jìn)而擾亂病毒的核輸出。此外，BSA偶聯(lián)的Rev激活結(jié)構(gòu)域（BSAR）能夠顯性抑制Rev 介導(dǎo)的RNA 核輸出[12]?？梢奟ev蛋白對(duì)于形成完整長度的病毒基因組RNA 至關(guān)重要，病毒基因組RNA 的核輸出是保證完整病毒RNA 的關(guān)鍵步驟。這些觀點(diǎn)支持了我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果——高比例的Rev 蛋白可顯著提高病毒的感染效率。高劑量Rev蛋白才能實(shí)現(xiàn)病毒基因組RNA的高效核輸出，避免其被細(xì)胞自身的防御系統(tǒng)降解。相對(duì)Rev 而言，gag/pol 的重要性次之，pLP1-gag/pol主要提供病毒的結(jié)構(gòu)蛋白及反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶特性，對(duì)于慢病毒活性毒粒必不可少。而VSVG 作為包膜蛋白，僅在細(xì)胞與病毒融合時(shí)發(fā)揮作用[13]，對(duì)于整個(gè)病毒的活性周期而言處于較次要的地位。綜上，我們得出了慢病毒包裝系統(tǒng)中4 個(gè)質(zhì)粒的相對(duì)優(yōu)先重要性等級(jí)，即目的質(zhì)粒＞Rev＞gag/pol＞VSVG。

已有的研究表明目的質(zhì)粒中插入片段長度與病毒滴度呈半對(duì)數(shù)形式負(fù)相關(guān)[1]，探索慢病毒包裝優(yōu)化體系應(yīng)選擇較長的目的質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，因此實(shí)驗(yàn)中選用了此前構(gòu)建的GFP 表達(dá)載體pHEGP。該載體在5'-LTR 與3'-LTR 間插入約2 kb 的片段，大小接近中等長度的基因插入片段。在此情況下進(jìn)行病毒包裝效率的改進(jìn)，可以更好地模擬實(shí)際基因功能研究中體系優(yōu)化的差異性。實(shí)驗(yàn)中對(duì)病毒包裝效率的評(píng)價(jià)采用未經(jīng)濃縮的病毒上清，是基于兩方面的考慮，一方面排除超速離心或超速過濾過程中的干擾因素，另一方面排除高滴度濃縮病毒可能對(duì)感染率差異的掩蓋。

針對(duì)建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系或難以進(jìn)行普通轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)，通過慢病毒進(jìn)行基因擾動(dòng)是當(dāng)前基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的主流方法。慢病毒不僅具有高效率滴度，而且對(duì)于發(fā)育早期的多能干細(xì)胞，尤其是造血干細(xì)胞具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。慢病毒包裝作為各大實(shí)驗(yàn)室及公司的重要技術(shù)基礎(chǔ)，建立優(yōu)化包裝體系以提高長基因過表達(dá)效率非常重要。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)低劑量的pLP-VSVG和相對(duì)高劑量的pLP2-Rev是優(yōu)化第三代慢病毒包裝體系的重點(diǎn)，這點(diǎn)在低MOI的293T 細(xì)胞系及較高M(jìn)OI 的K562 細(xì)胞系中都得到驗(yàn)證，為實(shí)現(xiàn)在血液細(xì)胞中相關(guān)基因的穩(wěn)定表達(dá)和后續(xù)功能研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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