張金龍 ，李冰，2，任軍，宋曉紅，張章，侯利華，于長明，付玲，楊秀旭，李建民

1.軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所 疫苗與抗體工程研究室，北京 100071；2.解放軍306醫(yī)院 檢驗科，北京 100000

炭疽是炭疽芽孢桿菌引起的人畜共患重大烈性傳染病。炭疽芽孢由于其強烈的致病力和極強的對環(huán)境的適應能力，一直被作為重要的生物戰(zhàn)劑及生物恐怖劑[1]。炭疽芽孢桿菌外毒素由保護性抗原（protective antigen，PA）、致死因子（lethal factor，LF）和水腫因子（edema factor，EF）3 種多肽組成[2-4]。針對PA 的單克隆抗體具有良好的保護性和安全性[5]，且其半衰期長、性質(zhì)穩(wěn)定，是目前最有前景的炭疽毒素抑制劑[6-7]。我們利用自主構建的表達抗PA 的人源化抗體的重組CHO 細胞，嘗試建立并優(yōu)化大規(guī)模哺乳動物細胞發(fā)酵后純化工藝，并對所獲得的產(chǎn)品的純度和活性進行檢測，為抗炭疽人源化抗體的生產(chǎn)及質(zhì)量控制打下基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

表達重組抗炭疽PA 人源化抗體的CHO 細胞株為本室構建保存[8-9]；小鼠巨噬細胞系J774A.1 由本室保存；層析介質(zhì)MabSelect Sure、SP-Sepharose Fast Flow、Sephadex G25，蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)AKTA purifier 購自GE 公司；Waters 2487/2695 HPLC 系統(tǒng)購自Waters 公司；TSK G3000 SWXL（7.8 mm×300 mm）購自TOSOH 公司；0.45 μm 微孔濾器、30kD 超濾系統(tǒng)購自Millipore公司。

1.2 發(fā)酵液處理

重組CHO 細胞培養(yǎng)液共50 L，經(jīng)12 000 r/min離心15 min，收集上清液，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，采用截留分子量為30kD 的濾膜超濾濃縮，得到約20 L超濾濃縮液。

1.3 MabSelect Sure親和層析

用5 倍柱體積的緩沖液A（20 mmol/L PB，0.15 mol/L NaCl，pH7.0）平衡親和層析柱，將超濾濃縮后的細胞培養(yǎng)液以200 mL/min 的流速上樣，上樣完畢后用緩沖液A 平衡層析柱，檢測波長280 nm，至基線后，用緩沖液B（0.1 mol/L 甘氨酸-HCl，0.15 mol/L NaCl，pH4.2）洗滌去除雜蛋白后，用緩沖液C（0.1 mol/L甘氨酸-HCl，0.15 mol/L NaCl，pH3.2）洗脫，收集洗脫液，靜置3 h，滅活病毒后，用1 mol/L Tris（pH9.0）中和至pH5.6。

1.4 SP-Sepharose FF陽離子交換層析

用5 倍柱體積的緩沖液D（50 mmol/L NaAc，pH5.6）平衡SP-Sepharose FF 陽離子交換層析柱，中和后的親和層析洗脫液稀釋至1/4后上樣，用緩沖液D 平衡層析柱，檢測波長280 nm，至基線后，用緩沖液E（50 mmol/L NaAc，0.25 mol/L NaCl，pH5.6）洗脫，收集洗脫液，層析介質(zhì)以1 mol/L NaOH 在位清洗，全過程流速50 mL/min。

1.5 Sephadex G25置換緩沖液

用5 倍體積的緩沖液A 平衡Sephadex G25 分子排阻層析柱，SP 陽離子洗脫蛋白質(zhì)樣品上樣，收集目標峰，全過程完成后，層析介質(zhì)以1 mol/L NaOH在位清洗，全過程流速50 mL/min。

1.6 蛋白質(zhì)含量檢測

發(fā)酵液上清中抗體蛋白質(zhì)含量采用ELISA 法估算；其他純化過程中蛋白質(zhì)含量采用紫外法檢測：采用島津UV-1601 紫外分光光度計，先用相應空白緩沖液歸零，然后將抗炭疽人源化抗體稀釋至D280nm值為0.3～0.8，分別精確測定D280nm及D320nm值，每個樣品測定3 次，取平均值，而后按照下式計算蛋白濃度（式中的抗炭疽人源化抗體的紫外光吸收系數(shù)為1.503）：

1.7 SDS-PAGE法檢測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量

采用還原型SDS-PAGE。取20 μg 抗體，加入等體積2×上樣緩沖液（含終濃度為1%的巰基乙醇），混勻后煮沸5 min。電泳結束后常規(guī)考馬斯亮藍染色，脫色后掃描分析結果。

1.8 SEC-HPLC檢測純度

采用Waters 2487/2695 高效液相色譜系統(tǒng)，分析柱為TSK G3000 SWXL 流動相為0.2 mol/L 磷酸鹽加0.15 mol/L NaCl（pH6.8），流速0.8 mL/min，上樣量50 μg，檢測280 nm 波長處吸收峰，譜圖結果用Empower 2軟件分析。

1.9 Western印跡

取PA 及等量牛血清白蛋白（BSA，作為陰性對照）進行非還原型SDS-PAGE。用100 mA恒流電轉3 h 將蛋白質(zhì)轉至PVDF 膜上，用3% BSA 室溫封閉2 h，加入用封閉液按1∶10 000 稀釋的抗炭疽人源化抗體，37℃孵育2 h，用TBST 洗膜3 次，加入用封閉液按1∶5000 稀釋的HRP 標記的羊抗人Fc 二抗，37℃孵育1 h，用TBST洗膜3次，化學發(fā)光法顯色。

1.10 體外細胞保護試驗

J774A.1 細胞以2×105/mL 接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，長至90%匯合后吸棄孔中培養(yǎng)液上清；將用培養(yǎng)液梯度稀釋的抗體與100 ng/mL PA 和100 ng/mL LF 于37℃共孵育1 h 后加入細胞培養(yǎng)孔中，37℃孵育3 h，加入25 μL MTT（5 mg/mL），37℃孵育30 min，吸棄上清，每孔加入100 μL 鹽酸異丙醇，振蕩至沉淀溶解，測定各孔的D570nm值。以只加單純新鮮培養(yǎng)基為全部存活對照孔，以未加抗體、只加PA 和LF 的培養(yǎng)液為全部死亡對照孔，D570nm值高于死亡對照孔0.1以上的細胞孔判為存活，此時的最大稀釋度定義為TNA（毒素中和試驗）效價。結果取2 個復孔的平均值。

1.11 其他檢測

委托軍事醫(yī)學科學院儀器測試分析中心采用MOLDI-TOF 法測定抗體蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量（Mr）；蛋白A 殘留檢測采用試劑盒（Cygnus Technologies，F(xiàn)050）法；宿主蛋白質(zhì)殘留檢測采用試劑盒（Cygnus Technologies，CM015）法；內(nèi)毒素等的檢測采用中國藥典（2010版）方法。

2 結果

2.1 分離純化及得率分析

MabSelect SuRe 親和層析初步捕獲抗體蛋白質(zhì)（圖1）；SP-Sepharose FF 陽離子交換層析實現(xiàn)了雜質(zhì)蛋白、抗體蛋白質(zhì)多聚體及色素的分離（圖2）；Sephadex G25 分子篩層析實現(xiàn)了緩沖液的交換（圖3）。各步得率見表1，總蛋白質(zhì)得率為61.7%。

2.2 SEC-HPLC檢測抗體純度

SEC-HPLC 檢測抗體純度結果見圖4，主峰保留時間8.608 min，百分比面積為99.25。故該法檢測所得抗體純度為99.25%。肩峰為二聚體，所占面積比例為0.75%。

2.3 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量檢測

圖1 MabSelect SuRe親和層析色譜圖

圖2 SP-Sepharose FF離子交換層析色譜圖

表1 目的蛋白質(zhì)純化各步效率及得率

抗體包括2條重鏈和2條輕鏈，其中成熟重鏈由452 個氨基酸殘基組成，理論Mr為49 717；輕鏈由213 個氨基酸殘基組成，理論Mr為23 219；還原SDS-PAGE 表明二者Mr均基本符合預期（圖5）。MOLDI-TOF檢測Mr為147 995，與預期相符（圖6）。

2.4 Western印跡結果

Western 印跡結果見圖7，可見抗體特異性地與PA發(fā)生結合。

圖3 Sephadex G25凝膠過濾層析色譜圖

圖4 SEC-HPLC法檢測抗體純度色譜圖

圖5 SDS-PAGE法檢測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量

圖6 MOLDI-TOF法檢測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量

2.5 體外細胞保護試驗

細胞存活率與抗體加入濃度有明顯的相關性，采用四參數(shù)法擬合曲線見圖8，并計算出該抗體的EC50值為0.1516 μg/mL。

2.6 其他檢測

經(jīng)檢測，蛋白A 含量為0.63 ng/mg 抗體，符合規(guī)定（≤0.01%）；宿主蛋白殘留量為0.62 ng/mg 抗體，符合規(guī)定（≤0.01%）；內(nèi)毒素含量等均符合中國藥典規(guī)定。

圖7 Western印跡鑒定PA的抗體結合特異性

圖8 PA細胞毒性中和作用實驗

3 討論

我們收集了激流式生物反應器所培養(yǎng)的CHO細胞發(fā)酵液上清，并采用Mabselect Sure 親和層析、SP-Sepharose FF，通過精確控制純化條件，實現(xiàn)了對抗炭疽人源化抗體的初步分離純化?，F(xiàn)在大多數(shù)廠家的分離純化工藝是發(fā)酵后進行深層過濾獲得澄清的上清，第一步進行親和層析，層析后產(chǎn)物進行低pH 放置滅活病毒，經(jīng)過濾后進行陰離子層析除去殘余DNA 和內(nèi)毒素，流穿液進行陽離子層析去除聚集體，洗脫產(chǎn)物進行納濾去除病毒的工藝，再經(jīng)過超濾和除菌過濾獲得原液。相比之下，我們的現(xiàn)有工藝略顯粗糙，還須進一步完善。例如，離心法澄清不適用于大規(guī)模生產(chǎn)，但可以通過簡單地將離心操作轉換為深層過濾或中空纖維柱微濾澄清，便可滿足各種規(guī)模的生產(chǎn)需要。另外，還須進一步進行病毒的滅活/去除工藝研究。

單抗藥物的質(zhì)量要求是生物制品中比較高的，也是比較難進行質(zhì)控的[10]。需要進行產(chǎn)品相關雜質(zhì)（分子大小和電荷異構體）、工藝相關雜質(zhì)（殘余宿主蛋白、殘余DNA 和泄漏的蛋白A 配基）、蛋白含量和生物活性、鑒別試驗和安全性（內(nèi)毒素和無菌）等研究[11]。現(xiàn)有質(zhì)量研究數(shù)據(jù)基本確認表達了正確的具有生物學活性的完整單抗，質(zhì)量控制則須進一步完善。需要建立Q-PCR 法檢測殘余DNA、離子高效液相色譜法考察電荷的異質(zhì)性及HPLC 方法分析糖型等檢測方法。

目前，炭疽的治療主要依靠抗菌素[12]，但在臨床上往往由于服用不及時、自然產(chǎn)生的或因對炭疽菌的人為改構而產(chǎn)生的耐藥性，使得抗菌素不能奏效，而抗PA 的人源化抗體在感染各期均可以對炭疽桿菌起的殺傷作用。美國政府非常重視炭疽的防控研究，早在2012年FDA 就批準人類基因組科學公司研制的Abthrax（raxi-bacumab）上市，用于炭疽的治療。目前國內(nèi)尚無同類用于急救的抗炭疽毒素藥物。本研究基于本室前期研究結果，為抗炭疽人源化抗體的規(guī)模化生產(chǎn)及質(zhì)控工作打下了基礎。

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