甲型流感病毒M2e通用疫苗的研究進(jìn)展

譚偉，謝芝勛

廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001

流感病毒屬于正粘病毒科，根據(jù)其基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）和核蛋白（nucleoprotein，NP）的不同，流感病毒分為甲、乙、丙共3 型[1-2]。季節(jié)性流感主要由甲型流感病毒H1、H3 亞型及乙型流感病毒所引起，不同年齡段的人群都可感染，特別是老人、嬰幼兒、免疫功能有缺陷的病人及慢性病患者更易感且發(fā)病癥狀較重，全世界每年有25～50 萬(wàn)人死于季節(jié)性流感[3-4]。人甲型流感病毒于1933 年首次分離成功[1]，1945 年第一個(gè)商品化人用流感滅活疫苗在美國(guó)投放市場(chǎng)[5]，不久又研制出流感病毒減毒活疫苗[1]。流感滅活疫苗通過(guò)肌肉內(nèi)接種，主要誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫；而流感病毒減毒活疫苗則經(jīng)鼻腔內(nèi)噴霧接種，同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫。

目前市場(chǎng)上的季節(jié)性流感疫苗包括人甲型流感病毒H1N1 亞型和H3N2 亞型的血凝素（haemagglutinin，HA）及乙型流感病毒的HA 三價(jià)苗[6]，在北美地區(qū)和我國(guó)主要采用三價(jià)疫苗，但也有一些國(guó)家和地區(qū)使用單價(jià)苗。季節(jié)性流感疫苗具有高度特異性，即對(duì)相同亞型的流感毒株預(yù)防效果良好，而對(duì)不同亞型流感毒株的預(yù)防效果則不理想。由于流感病毒的HA 蛋白易于發(fā)生抗原變異[7]，常會(huì)導(dǎo)致流感疫苗生產(chǎn)株與流行株的抗原性不一致，使疫苗起不到保護(hù)作用。生產(chǎn)季節(jié)性流感疫苗需要每年春季根據(jù)各地流感病毒流行株的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，預(yù)測(cè)在當(dāng)年冬季可能出現(xiàn)的流感病毒流行株，并篩選出相應(yīng)的流感毒株來(lái)制備疫苗。傳統(tǒng)的流感疫苗生產(chǎn)周期長(zhǎng)、工藝復(fù)雜，且生產(chǎn)能力受不含特定病原體（specific-pathogen free，SPF）雞胚供應(yīng)量的限制。此外，易感人群每年都要接種新的疫苗來(lái)預(yù)防季節(jié)性流感，且老年人的疫苗接種效果常欠佳[6]。流感滅活疫苗的免疫保護(hù)期短、不易刺激產(chǎn)生細(xì)胞免疫，無(wú)法預(yù)防流感病毒變異株引發(fā)的全球性流感。因此，人們期望能研發(fā)出一種流感通用疫苗來(lái)預(yù)防所有亞型流感病毒的感染，并解決上述一系列難題。我們將介紹基于M2e短肽的甲型流感病毒通用疫苗的研究進(jìn)展。

1 甲型流感病毒通用疫苗的概念

目前廣泛使用的季節(jié)性流感疫苗主要預(yù)防H1、H3亞型的甲型流感病毒和乙型流感病毒的感染，而不能預(yù)防其他亞型的甲型流感病毒（如H5、H7和H9等亞型）的感染，因此，流感通用疫苗的理念應(yīng)運(yùn)而生[8-9]。甲型流感病毒通用疫苗利用不同亞型流感病毒含有的共同抗原表位誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)反應(yīng)，來(lái)預(yù)防所有亞型流感病毒的感染。流感通用疫苗還可以避免每年篩選流感疫苗生產(chǎn)株的麻煩，降低疫苗的生產(chǎn)成本。

理想的甲型流感病毒通用疫苗應(yīng)能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)所有亞型流感病毒的保護(hù)性免疫，包括體液免疫和細(xì)胞免疫。因此，用于流感病毒通用疫苗的免疫原應(yīng)含有能引起交叉保護(hù)反應(yīng)的B 細(xì)胞和T 細(xì)胞抗原表位。目前用于甲型流感病毒通用疫苗研發(fā)的免疫原主要包括流感病毒的M2 離子通道蛋白、M2 蛋白的外膜區(qū)（M2e）、HA蛋白的莖部區(qū)、NP蛋白、酸性聚合酶（PA）和基質(zhì)蛋白（M1）等[3]，這些病毒蛋白含有相對(duì)保守的氨基酸序列，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)反應(yīng)。

1.1 M2e短肽流感通用疫苗的研究

M2e 短肽是流感病毒M2 蛋白暴露于外膜的部分。M2 蛋白最早是由Lamb 等于1981 年發(fā)現(xiàn)[10]，它鑲嵌于流感病毒囊膜中，形成受pH 調(diào)控的質(zhì)子通道，并參與病毒脫殼及新生病毒子粒的裝配和釋放過(guò)程[11-12]。起初研究者利用M2蛋白作為通用疫苗的免疫原[13]，但M2是膜蛋白，由97個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量較大，不易分離純化；而M2e短肽只有24 個(gè)氨基酸殘基，分子較小，溶于水并易于純化，因此M2e短肽更適合作為流感通用疫苗的免疫原。

圖1 來(lái)源于人、禽和豬流感病毒的M2e短肽序列

M2蛋白的N端含有24個(gè)氨基酸殘基，暴露于病毒囊膜表面或感染細(xì)胞的表面，與新生病毒顆粒的裝配有關(guān)，被稱作M2e（圖1）[14]；而M2 蛋白C 端的54個(gè)氨基酸殘基能與M1基質(zhì)蛋白相互作用，影響病毒顆粒的裝配和釋放[14]。M2e 的氨基酸序列在人、禽和豬等甲型流感病毒中都很保守[1,15]。Liu 等分析比較了人、禽和豬流感病毒M2e短肽的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)人源與禽源流感病毒M2e 短肽有5 個(gè)氨基酸殘基不同，而人源與豬源流感病毒M2e 短肽僅有2 個(gè)殘基不同（圖1）[16-17]。M2e 短肽N 端的8 個(gè)氨基酸殘基（殘基2～9：SLLTEVET）在不同亞型的甲型流感病毒中的同源性超過(guò)99%，而在人甲型流感病毒中的保守性可達(dá)100%[15]，因此針對(duì)人M2e 短肽的免疫血清能夠識(shí)別禽M2e的序列[18]。

M2e 短肽可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)多種亞型流感病毒的抗體，因此M2e 是研發(fā)流感通用疫苗的首選免疫原之一。M2e短肽與適當(dāng)?shù)妮d體分子結(jié)合或與流感滅活疫苗同時(shí)使用，可以減輕流感癥狀，提高免疫動(dòng)物抵抗流感病毒攻擊的能力，產(chǎn)生較好的交叉免疫保護(hù)[19]。動(dòng)物試驗(yàn)和人體臨床試驗(yàn)的初步結(jié)果都顯示，M2e 流感通用疫苗安全、免疫原性好，且無(wú)明顯的副作用[2,20]。

1.2 M2e通用疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制

目前關(guān)于流感病毒HA 蛋白中和抗體的免疫保護(hù)機(jī)制已研究得比較清楚，針對(duì)HA 蛋白的血凝抑制抗體可以有效地中和游離的流感病毒及與細(xì)胞結(jié)合的病毒，有效預(yù)防流感發(fā)生。針對(duì)神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗體雖不具有直接中和流感病毒的作用，但它能夠抑制NA 蛋白的活性，使得新生病毒粒子在細(xì)胞表面聚集，降低感染細(xì)胞的排毒量[21]。針對(duì)流感病毒NP和M蛋白的T細(xì)胞免疫能幫助清除流感病毒感染的細(xì)胞[22]。

M2e 誘導(dǎo)產(chǎn)生的確切保護(hù)機(jī)制仍不明了[23]。雖然針對(duì)M2e 短肽的抗體不能中和流感病毒，但它可提供交叉保護(hù)免疫并減輕流感癥狀[23-24]。M2e 短肽和載體分子結(jié)合或與佐劑聯(lián)合使用，可以明顯抑制不同亞型流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，降低流感病毒在肺組織中的滴度和感染動(dòng)物的排毒量，提高免疫動(dòng)物的存活率，而且這種保護(hù)作用還可以通過(guò)其免疫血清被動(dòng)轉(zhuǎn)移給未經(jīng)免疫的動(dòng)物[8,25]。

目前普遍認(rèn)為Fc 受體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的吞噬作用、NK 細(xì)胞的直接殺傷作用、抗體依賴性細(xì)胞毒性、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解等多種機(jī)制均可能與M2e通用疫苗的保護(hù)作用有關(guān)[1,18,26-28]。因此，進(jìn)一步研究M2e 通用疫苗誘導(dǎo)免疫保護(hù)的機(jī)制，對(duì)弄清M2e 通用疫苗產(chǎn)生保護(hù)的途徑，建立評(píng)估M2e 通用疫苗效力的檢測(cè)方法，具有十分重要的意義。

2 M2e通用疫苗的特點(diǎn)及提高M(jìn)2e通用疫苗免疫效果的方法

2.1 M2e通用疫苗的特點(diǎn)

盡管目前M2e 產(chǎn)生的免疫保護(hù)機(jī)制尚不清楚，但M2e 依然是一個(gè)頗具潛力的流感通用疫苗免疫原，理由主要如下：①M(fèi)2e疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有良好的保護(hù)效果；②M2e 的氨基酸序列在絕大多數(shù)甲型流感病毒株中高度保守，自1933 年分離出流感病毒以來(lái)M2e 的序列幾乎未變，用其作為疫苗可避免常規(guī)流感疫苗只具有“毒株特異性免疫”的不足[15]；③M2e 疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生交叉保護(hù)免疫反應(yīng)，減少疫苗生產(chǎn)對(duì)流感病毒流行株預(yù)測(cè)結(jié)果的依賴，提前生產(chǎn)儲(chǔ)備性疫苗預(yù)防突發(fā)性流感大流行；④M2e 大量存在于感染細(xì)胞的表面，容易被抗體識(shí)別[29]；⑤M2e的分子小，易于體外大量表達(dá)、純化、制備；⑥M2e與適當(dāng)?shù)妮d體分子結(jié)合后，可大幅度提高其免疫原性及增強(qiáng)M2e疫苗的穩(wěn)定性。

2.2 提高M(jìn)2e通用疫苗免疫效果的方法

M2e 短肽的免疫原性不夠強(qiáng)[30]，常需要加強(qiáng)免疫。為了克服這些不足，研究人員將不同的載體分子與M2e 短肽結(jié)合以增強(qiáng)M2e 短肽的免疫原性，提高M(jìn)2e通用疫苗的免疫效果。目前常用的載體分子有乙型肝炎病毒核心蛋白（HBc）、人乳頭狀瘤病毒結(jié)構(gòu)蛋白L1、鑰孔血藍(lán)素、腦膜炎奈瑟菌外膜復(fù)合體、脂質(zhì)體及鞭毛蛋白等[2,4]。

2.2.1 M2e 四聚體通用疫苗 在流感病毒感染的細(xì)胞表面，M2 蛋白是以四聚體形式存在的，De Filette等發(fā)現(xiàn)針對(duì)M2 蛋白四聚體的抗體的保護(hù)效果明顯優(yōu)于針對(duì)其單體的抗體[31]。將酵母轉(zhuǎn)錄激活蛋白GCN4（general control nondepressible 4）四聚體與M2e 融合可形成M2e-GCN4 四聚融合體，明顯提高M(jìn)2e 短肽的免疫原性[31]。小鼠接種這種M2e-GCN4融合蛋白后，產(chǎn)生針對(duì)M2e的特異性抗體，即使小鼠在致死攻毒劑量情況下，100%被攻毒的小鼠均得到免疫保護(hù)而存活[31]。

2.2.2 M2e-病毒樣顆粒疫苗 病毒樣顆粒（viruslike particle，VLP）是指由病毒的結(jié)構(gòu)蛋白自行裝配而成的、不具感染性、不能復(fù)制的病毒蛋白顆粒。通過(guò)VLP 表達(dá)的蛋白能保持蛋白的天然構(gòu)象及活性，并具有多價(jià)、免疫原性強(qiáng)等特點(diǎn)[17]。VLP 能使大量相同的外源免疫原（例如M2e）在VLP 表面有序排列，從而大幅提高外源蛋白的免疫原性和穩(wěn)定性，因此通過(guò)表達(dá)M2e-VLP 可提高M(jìn)2e 的免疫原性。由于沒(méi)有流感病毒HA及NA這2種主要表面蛋白的遮蔽，并且M2e 短肽能以天然膜蛋白的形式充分暴露于VLP 表面，使M2e 便于被抗體識(shí)別。M2e-VLP 與流感滅活疫苗合用可提高M(jìn)2e 誘導(dǎo)的交叉保護(hù)效果，抵抗不同亞型的甲型流感病毒（H1N1、H3N2 及H5N1）的攻擊，而且這種交叉保護(hù)作用可以經(jīng)抗血清轉(zhuǎn)移給未被免疫的動(dòng)物[19,32]。通過(guò)將M2e 與HBc的N 端融合，可產(chǎn)生M2e-HBc 融合蛋白。這種疫苗的免疫原性強(qiáng)，可大大降低流感病毒感染后的發(fā)病率，并提高小鼠攻毒后的存活率[8]。

2.2.3 M2e 多表位通用疫苗與佐劑聯(lián)合使用 含有多個(gè)M2e短肽的通用疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)M2e的抗體[25]，若將人源、禽源及豬源的M2e 短肽通過(guò)VLP 的形式同時(shí)表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的交叉保護(hù)反應(yīng)更強(qiáng)，免疫保護(hù)持續(xù)的時(shí)間也更長(zhǎng)[33-34]。將M2e 與HA2、NP 或M1 蛋白中保守的抗原表位共同表達(dá)，亦可提高M(jìn)2e通用疫苗交叉保護(hù)的效果[35-36]。M2e 多表位疫苗與佐劑聯(lián)合也可提高M(jìn)2e 通用疫苗的保護(hù)效果。將M2e-HBc 與黏膜佐劑CTA1-DD 聯(lián)合使用，通過(guò)鼻腔內(nèi)接種，可誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，使免疫動(dòng)物獲得完全的保護(hù)[15,37]。目前用于流感通用疫苗研發(fā)的佐劑還包括革蘭陰性菌外膜鞭毛蛋白、MF59、CpG 寡核苷酸及免疫刺激復(fù)合物（immune stimulating complex，ISCOM）[35]。ISCOM 的特點(diǎn)是可以誘導(dǎo)產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，降低疫苗使用量，且免疫力持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。

3 M2e通用疫苗的試驗(yàn)動(dòng)物模型

M2e通用疫苗在小鼠、雪貂、豬和恒河猴中表現(xiàn)出了不同程度的保護(hù)效果[2,38]。小鼠不是流感病毒的天然宿主，本身對(duì)流感病毒不易感，若以小鼠為流感病毒的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，則需要產(chǎn)生能適應(yīng)于小鼠組織的流感病毒株[39]。豬是甲型流感病毒的天然中間宿主，可被多種亞型的人或禽流感病毒感染，以豬作為流感病毒感染的動(dòng)物模型可能要優(yōu)于小鼠模型。雪貂對(duì)人流感病毒株易感，產(chǎn)生的流感癥狀與人流感相似，是流感病毒感染常用的動(dòng)物模型[40]。恒河猴與人在免疫系統(tǒng)方面更相近，采用恒河猴作為流感病毒的感染模型所得到的結(jié)果可能與人體實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近[20]。大動(dòng)物模型是否比小動(dòng)物模型能更客觀地反映M2e 通用疫苗的實(shí)際保護(hù)效果，值得進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)語(yǔ)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體臨床試驗(yàn)都表明，M2e 流感通用疫苗安全，具有較好的免疫原性和交叉免疫保護(hù)效果，無(wú)明顯的副作用，顯示出其良好的發(fā)展前景。理想的M2e流感通用疫苗應(yīng)能有效刺激產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，抵御不同亞型流感病毒的感染[41]，并具有保護(hù)效果好、免疫力持久、適用于不同年齡段的易感人群等特點(diǎn)。

深入探索M2e 的免疫保護(hù)機(jī)制，找出能反映M2e 通用疫苗免疫保護(hù)作用的免疫學(xué)及生物學(xué)指標(biāo)，有助于建立有效評(píng)估M2e 疫苗免疫效果的方法。M2e 流感通用疫苗的近期發(fā)展目標(biāo)，應(yīng)以能降低流感病人死亡率、減輕流感的臨床癥狀、減少患者排毒量及控制病毒傳播為主；同時(shí)應(yīng)探索M2e 通用疫苗和佐劑配合使用及疫苗接種的最佳途徑，進(jìn)一步提高M(jìn)2e疫苗的交叉免疫保護(hù)效果及免疫持續(xù)時(shí)間。而制備安全、高效和成本低的M2e通用疫苗，則是流感通用疫苗研發(fā)的最終目標(biāo)之一。

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