楊 芳，李 凱，黃凌風(fēng)，3＊，朱小明

（1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門361102；2.廈門大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳518057；3.濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廈門大學(xué)），4.廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建 廈門361102）

植物修復(fù)（phytoremediation）是指利用植物及其根際微生物的代謝活動來吸收、積累或降解轉(zhuǎn)化環(huán)境中的污染物以達(dá)到凈化、修復(fù)環(huán)境的目的.植物修復(fù)方式包括植物萃取、根際過濾、植物固定、植物揮發(fā)、植物降解和根際降解.其中，根際降解又稱為植物－微生物協(xié)同修復(fù)，是指綠色植物及其共存微生物體系，通過促進(jìn)植物的根系和根系周圍微生物的活性和生化反應(yīng)，使污染物釋放、吸收和轉(zhuǎn)化而降低或去除其毒性，達(dá)到凈化環(huán)境的一種污染治理技術(shù).

植物根際環(huán)境存在著胞外酶（extracellular enzymes），胞外酶可能由植物根系釋放，也可能由根際微生物分泌.在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，只有小部分的溶解有機(jī)物（DOM）可以直接通過細(xì)胞膜被異養(yǎng)微生物所利用，但這遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足微生物的營養(yǎng)需求.約80%～90%的DOM以高聚物（如蛋白質(zhì)等）的形式存在，但無法被直接吸收利用，只有通過胞外酶的解聚作用才能使它們轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿佑袡C(jī)物，從而被異養(yǎng)微生物吸收［1－3］.大部分已知的亮氨酸氨基肽酶能以胞外酶的形式出現(xiàn)，并能通過水解那些不能直接穿透進(jìn)入有機(jī)體的多肽和蛋白質(zhì)，釋放出游離的氨基酸，從而供細(xì)菌利用.已有的研究表明，胞外酶的分解作用是有機(jī)質(zhì)降解的關(guān)鍵因素，胞外酶活性的大小能從一定程度上反映有機(jī)物的降解速率.胞外酶在有機(jī)質(zhì)的礦化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，控制著生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)，在一定程度上決定著生態(tài)系統(tǒng)的凈化功能［4］.胞外酶活性還可以作為反映水體富營養(yǎng)化程度的指標(biāo)［5］.因此，胞外酶的研究對于全面理解生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、評估水域環(huán)境質(zhì)量和探討生態(tài)修復(fù)機(jī)制等都具有重要意義.

海馬齒（Sesuvium portulacastrumLinn.）又名濱水菜，為番杏科（Aizonaceae）海馬齒屬（Sesuvium）植物，是生長在海邊沙地或鹽堿地的多年生匍匐性肉質(zhì)草本植物，在我國主要分布于福建、廣東、海南、臺灣及澎湖列島的海岸［6］，浮床種植海馬齒可在海水環(huán)境中正常生長.海洋灘涂耐鹽植物海馬齒作為一種應(yīng)用于海水生態(tài)浮床技術(shù)的重要修復(fù)植物，其對富營養(yǎng)化水體的氮、磷營養(yǎng)鹽和有機(jī)質(zhì)的去除能力已得到了一定的認(rèn)識和肯定［7］，但關(guān)于其修復(fù)機(jī)制，尤其是根圈系統(tǒng)對海水環(huán)境中蛋白質(zhì)等有機(jī)質(zhì)降解的相關(guān)酶學(xué)機(jī)制的研究報(bào)道還很少.牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是常用的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，在可溶性蛋白質(zhì)含量的測定等蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用［8－10］.本文報(bào)道了水培海馬齒對以BSA為代表的可溶性蛋白質(zhì)的根際降解作用及其與根際微生物胞外水解酶活性有關(guān)的影響因素，旨在探討海馬齒根系及其根際微生物在蛋白質(zhì)等有機(jī)質(zhì)降解中所發(fā)揮的重要作用，為更好地利用海馬齒生態(tài)浮床修復(fù)海水環(huán)境中的有機(jī)氮提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)用海馬齒植株為本實(shí)驗(yàn)室從西沙群島引種并在溫室中通過水培方法建立的植株，培養(yǎng)用水為廈門西海域海水.單株平均鮮質(zhì)量為（15.0±0.5）g，根系發(fā)育良好.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

取同一批預(yù)培養(yǎng)的海馬齒植株，剔除枯黃葉片并清洗后稱量，選擇長勢均勻、鮮質(zhì)量為每株（15.0±0.5）g的植株，在經(jīng)0.22μm濾膜過濾并滅菌的海水中暫養(yǎng)7d，以獲得含根際微生物的預(yù)培養(yǎng)水.

設(shè)置了抑菌和不抑菌2組實(shí)驗(yàn)，每組又分為種植海馬齒的植物組、不種植海馬齒的細(xì)菌組和空白對照組.每組分別設(shè)置3個平行樣.

抑菌實(shí)驗(yàn)根據(jù) Weinberger［11］的方法采用3種抗生素，分別是氨芐霉素（ampicillin）、頭孢噻肟（cefotaxime）和萬古霉素（vancomcin），添加質(zhì)量濃度均為100mg／L.這3種抗生素既可以同時抑制G＋和G－菌形成細(xì)胞壁，又不會對植物的生理活動產(chǎn)生影響［12］.預(yù)實(shí)驗(yàn)表明該抗生素濃度能抑制水中微生物的繁殖，但不影響植物的正常生長.不抑菌實(shí)驗(yàn)不添加抗生素.

每個樣品的培養(yǎng)液初始體積是500mL.植物組和細(xì)菌組的培養(yǎng)用水是400mL經(jīng)0.22μm濾膜過濾的滅菌海水和100mL根際預(yù)培養(yǎng)水混合而成.對照組的培養(yǎng)用水是400mL經(jīng)0.22μm濾膜過濾的滅菌海水和100mL經(jīng)0.22μm濾膜過濾并滅菌的根際預(yù)培養(yǎng)水混合而成.每組加入營養(yǎng)鹽以滿足植物生長的需要，各種營養(yǎng)鹽按照Hoagland配方添加.

不抑菌實(shí)驗(yàn)中，對照組用于反映非生物因素在蛋白質(zhì)降解中的作用，細(xì)菌組用于反映根際細(xì)菌和非生物因素在蛋白質(zhì)降解中的作用，植物組用于反映植物、根際細(xì)菌和非生物因素在蛋白質(zhì)降解中的作用.抑菌實(shí)驗(yàn)中的植物組用于反映植物根系和非生物因素在蛋白質(zhì)降解中的作用.利用差減法計(jì)算的結(jié)果可以分別顯示植物與根際細(xì)菌聯(lián)合作用、植物根系以及根際細(xì)菌對蛋白質(zhì)根際降解的貢獻(xiàn)率.

實(shí)驗(yàn)裝置由柱狀玻璃容器（Ф：5.0cm，L：30 cm）、日光燈光源和取樣管組成.柱狀玻璃容器外表面和瓶口緊密包裹鋁箔，以防止外源微生物污染、蛋白質(zhì)的光解和藻類的生長.日光燈置于柱狀玻璃容器上方約50cm 處，在室溫（28±2）℃，12h光照（6 000lx）和12h黑暗交替條件下培養(yǎng).為了減少取樣時根際水體的擾動，用一次性無菌注射管作為取樣管，放置于柱狀玻璃瓶中，外用橡皮筋固定，并用止水夾保持培養(yǎng)體系密閉以防止外源微生物污染和工作液中溶解氧的改變.

每隔12h取樣一次，每次取樣時用一次性注射管吸取10mL水樣用于BSA濃度、細(xì)菌密度和亮氨酸氨基肽酶活性的測定.分別在36和72h取樣后，再次添加BSA（質(zhì)量濃度為10mg／L）、Hoagland營養(yǎng)鹽和3種抗生素（質(zhì)量濃度均為100mg／L，僅在抑菌實(shí)驗(yàn)組中添加）.

1.3 主要分析指標(biāo)和方法

1.3.1 BSA含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法.取125mg考馬斯亮藍(lán)G－250充分溶解在100mL 95%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇中，另取15mL 37%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的 HCl和5.06g NaCl溶解在適量水中后，與考馬斯亮藍(lán)乙醇液混合并定容至1 000mL，用0.45μm 濾膜過濾，即為顯色液.測定時，取5mL顯色液與1mL水樣混合，放置5min后用Spectum 756PC型紫外可見分光光度計(jì)在波長595nm下測定吸光值.

同時，配制質(zhì)量濃度為0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20μg／mL的BSA溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.2 亮氨酸氨基肽酶活性的測定

采用熒光模擬底物法（fluorogenic model substrate，F(xiàn)MS）［13］.如圖1所示，熒光模擬底物包含一個熒光生色團(tuán)和一個小分子，熒光生色團(tuán)采用4－甲基－7－氨基香豆素（MCA），小分子為氨基酸，兩者之間通過肽鍵相連.在氨基肽酶的作用下，復(fù)合分子發(fā)生斷裂，熒光基團(tuán)顯色.胞外酶的活性越高，復(fù)合分子斷裂的越多、越快，因此熒光強(qiáng)度越高.這種模擬底物的胞外酶水解作用符合米氏方程，檢測限低，適合短時間條件下的胞外酶測定.該方法以其高度的靈敏度已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種水體的胞外酶活性測定中［14－17］.

圖1 熒光模擬底物水解方程式Fig.1 Reaction equator of model substrate

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制100μmol／L MCA的乙二醇單甲醚溶液，再用過濾滅菌海水稀釋成0.000 5，0.001，0.002 5，0.005，0.007 5，0.01，0.025，0.05，0.075，0.1，0.25，0.5，0.75，1μmol／L 14個濃度的溶液.用島津RF5301PC熒光分光光度計(jì)迅速測定各溶液的熒光強(qiáng)度.MCA激發(fā)光和發(fā)射光的波長分別為380和440nm.狹縫寬Ex＝3nm，Em＝3nm.

酶活性的測定方法如下：移取3mL水樣到5個5 mL的凍存管中（2個空白樣和3個平行樣），立即往平行樣中加入0.5mmol／L熒光模擬底物工作液120 μL，使其終濃度為20μmol／L；同時在空白樣中加入80μL濃度為100mmol／L的HgCl2溶液使胞外酶失活，在20℃下避光培養(yǎng)2h.培養(yǎng)結(jié)束后在空白樣中加入等量的熒光模擬底物工作液，并用HgCl2溶液終止平行樣中的反應(yīng).用島津RF5301PC熒光分光光度計(jì)迅速測定樣品的熒光強(qiáng)度.按下式計(jì)算水樣中的胞外酶活性：

式中，V 為胞外酶水解底物的速率（μmol／（L·h））；F為平行樣品的熒光強(qiáng)度（平均值，μmol／L）；Fb為空白樣品的熒光強(qiáng)度（平均值，μmol／L）；S為單位濃度標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度（S＝79.807），即標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率；t為培養(yǎng)時間（h）.

1.3.3 細(xì)菌密度測定

采用DAPI染色的熒光顯微計(jì)數(shù)法［18］，測定前將孔徑為0.22μm的硝酸纖維濾膜用蘇丹黑B染液（500mg Sudan Black B溶于200mL 2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）乙酸中）染色4h以上，使之變黑.取1mL水樣加入2 mL滅菌離心管中，加入40μL 25%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛溶液固定，再加入20μL DAPI染液（質(zhì)量濃度為20 μg／mL），避光染色5min后，在小于7 093Pa負(fù)壓下過濾，濾干后取濾膜制片，用Leica DM 4500B型熒光顯微鏡進(jìn)行熒光顯微計(jì)數(shù).按下式計(jì)算水樣中的細(xì)菌密度

式中，D為細(xì)菌密度（mL－1）；A 為10個視野的細(xì)菌平均數(shù)（cell）；S1為視野面積（cm2）；S2為濾膜的有效過濾面積（cm2）；V 為過濾水樣體積（mL）.

1.4 數(shù)據(jù)分析

測量數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)用Origin 8.1和SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，處理組間差異的顯著性采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 BSA的降解

不抑菌實(shí)驗(yàn)中，每次添加蛋白質(zhì)后，植物組的蛋白質(zhì)濃度下降最快（圖2）.細(xì)菌組的變化趨勢與對照組相似，并且其水體中蛋白質(zhì)濃度都是隨著添加次數(shù)的增多而逐漸積累升高.36h后，植物組、細(xì)菌組和對照組蛋白的平均降解率分別是97%、41%和26%，細(xì)菌組的蛋白降解率低于植物組.利用差減法扣除非生物因素作用（26%），海馬齒與根際微生物聯(lián)合作用下的降解率（71%）是根際微生物作用（15%）的4.73倍.表明單獨(dú)的根際微生物可以降解蛋白質(zhì)，但是其降解率不高，要實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高效降解必須以海馬齒根系為依托.

在抑菌實(shí)驗(yàn)中，植物組、細(xì)菌組和對照組的變化趨勢一致，都是隨著添加次數(shù)的增多，蛋白質(zhì)濃度逐漸升高（圖3）.植物組并沒有表現(xiàn)出明顯高于其他組的降解效率.表明單獨(dú)的海馬齒根系無法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高效降解.蛋白質(zhì)的濃度在每次添加后期有所升高，呈現(xiàn)“V”型的變化特點(diǎn)，推測原因可能是部分吸附在瓶壁上的蛋白質(zhì)由于室溫變化等原因發(fā)生了解吸，導(dǎo)致后期濃度有所上升.

以上結(jié)果說明，單獨(dú)的根際微生物或海馬齒根系都無法實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的高效降解.海馬齒根系與根際微生物聯(lián)合在蛋白質(zhì)的根際降解中發(fā)揮著極為重要的作用.

2.2 BSA降解過程中細(xì)菌密度的變化

圖2 不抑菌實(shí)驗(yàn)中BSA質(zhì)量濃度隨時間的變化Fig.2 Changes of BSA concentration in the experiment groups without antibiotic addition

圖3 抑菌實(shí)驗(yàn)中BSA質(zhì)量濃度隨時間的變化Fig.3 Changes of BSA concentration in the experiment groups with antibiotic addition

在不抑菌實(shí)驗(yàn)中，在0到36h內(nèi)，植物組蛋白質(zhì)的高效降解為細(xì)菌生長提供營養(yǎng)，其細(xì)菌密度的增長速度明顯快于細(xì)菌組.植物組和細(xì)菌組的細(xì)菌密度基本都是呈現(xiàn)初期快速增長、中期下降和后期基本穩(wěn)定的單峰型變化趨勢（圖4）.而整個實(shí)驗(yàn)過程中，對照組沒有檢測到細(xì)菌的存在，可以有效反映非生物因素的作用.

在抑菌實(shí)驗(yàn)中，對照組沒有檢測到細(xì)菌的存在.植物組和細(xì)菌組的細(xì)菌密度基本都呈下降趨勢（圖5），細(xì)菌密度分別從開始時的3.0×105和2.8×105mL－1逐漸下降到結(jié)束時的0.7×105和0.5×105mL－1，其數(shù)量與不抑菌實(shí)驗(yàn)相比，可以忽略不計(jì).表明實(shí)驗(yàn)所采用的抗生素可以有效抑制細(xì)菌數(shù)量的增長，抑菌實(shí)驗(yàn)中的植物組可以較好地反映單純海馬齒根系在蛋白質(zhì)降解中的作用.

2.3 BSA降解過程中亮氨酸氨基肽酶活性的變化

圖4 不抑菌實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌密度隨時間的變化Fig.4 Changes of bacterial density in the experiment groups without antibiotic addition

圖5 抑菌實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌密度隨時間的變化Fig.5 Changes of bacterial density in the experiment groups with antibiotic addition

在抑菌實(shí)驗(yàn)中，雖然細(xì)菌組和植物組的細(xì)菌密度在0～12h時可達(dá)105mL－1，但是對照組、細(xì)菌組和植物組都沒有檢測到亮氨酸氨基肽酶活性，表明抑菌實(shí)驗(yàn)的抗生素抑菌效果良好，細(xì)菌活性受到了全面抑制，而單純的海馬齒根系不分泌亮氨酸氨基肽酶.由此可以推斷，在不抑菌實(shí)驗(yàn)中檢測到較高活性的亮氨酸氨基肽酶完全是由根際微生物所分泌.

不抑菌實(shí)驗(yàn)中，對照組沒有檢測到亮氨酸氨基肽酶活性，只有植物組和細(xì)菌組有明顯的酶活（圖6）.這2組的酶活性變化趨勢較為相似，而植物組的酶活性始終高于細(xì)菌組.實(shí)驗(yàn)開始的24h內(nèi)，植物組的酶活性急劇上升，24h時達(dá)到最高值0.75μmol／（L·h），此后酶活性呈下降趨勢，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，酶活性下降到0.22μmol／（L·h）.細(xì)菌組的酶活性最高值出現(xiàn)在60 h，達(dá)到0.43μmol／（L·h），在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，酶活性檢測不到.從整體上看，植物組和細(xì)菌組的酶活性也是基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢.

圖6 不抑菌實(shí)驗(yàn)中亮氨酸氨基肽酶活性隨時間的變化Fig.6 Changes of leucine amino peptidase activity in the experiment groups without antibiotic addition

與細(xì)菌組相反，植物組的酶活性最高值出現(xiàn)時間（24h）早于細(xì)菌密度最高值（36h）.說明在海馬齒根系和根際微生物聯(lián)合作用下，植物組蛋白質(zhì)的高效降解過程伴隨著酶活性的升高和細(xì)菌密度的增加，且酶活性的升高先于細(xì)菌數(shù)量的增長.

3 討 論

抑菌實(shí)驗(yàn)中的植物組沒有檢測出亮氨酸氨基肽酶活性，表明該蛋白酶完全由根際微生物分泌，海馬齒根系不分泌該種胞外酶.大部分水環(huán)境中的研究表明亮氨酸氨基肽酶活性主要是由異養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)生的［19－21］.而也有研究者認(rèn)為蛋白酶可以由植物根系釋放，如Gramms等［22］研究發(fā)現(xiàn)，豆科、禾本科和茄科的一些植物種類能夠向根系區(qū)域大量釋放氧化酶和水解酶，這些酶包括蛋白酶、過氧化物酶、漆酶、單酚氧化酶、脂肪酶以及酯酶等.另有研究表明，亮氨酸氨基肽酶是植物體內(nèi)廣泛存在的一種金屬蛋白酶［23］，可以有效切割N端的亮氨酸、精氨酸和蛋氨酸殘基［24］，可能對蛋白半衰期具有重要的調(diào)節(jié)作用，關(guān)系細(xì)胞的生長和凋亡［25］.

從整體上看，不抑菌實(shí)驗(yàn)中的植物組和細(xì)菌組的酶活基本呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這一趨勢基本上符合目前比較流行的胞外酶活性調(diào)控機(jī)制——“抑制－誘導(dǎo)”假說［26－27］.該學(xué)說認(rèn)為當(dāng)海水中存在大量初級代謝產(chǎn)物以及光合作用產(chǎn)物時，這些易于被吸收利用的低分子質(zhì)量產(chǎn)物（UDOM）容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以維持細(xì)菌的正常生長及新陳代謝.同時這些UDOM（如氨基酸、單糖和有機(jī)酸等）限制了胞外酶的活性（產(chǎn)物抑制）并且抑制了酶的合成（代謝抑制）.而當(dāng)海水中的UDOM降低到臨界值，藻類細(xì)胞通過裂解釋放出大量的高分子化合物（如蛋白質(zhì)、多糖、酯類或核酸等）時，胞外酶的抑制被解除，酶活性顯著升高.

在不抑菌實(shí)驗(yàn)中，植物組的酶活性最高值和細(xì)菌密度最大值的出現(xiàn)時間均早于細(xì)菌組，并且植物組的酶活始終高于細(xì)菌組.表明海馬齒根系可以促進(jìn)根際細(xì)菌的生長和亮氨酸氨基肽酶活性的升高.也有其他研究證實(shí)植物根系可以增強(qiáng)根際胞外酶活性［28－30］，如棉花、小麥、水芹、西紅柿和水葫蘆等植物能向根際環(huán)境中提供氨基酸、糖類和維生素等養(yǎng)料，改善根際微生態(tài)環(huán)境，間接促進(jìn)胞外酶活性的升高.

由于亮氨酸氨基肽酶完全由根際細(xì)菌分泌，根際細(xì)菌在蛋白質(zhì)的根際降解過程中起著主要的作用，但是不抑菌實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌組的降解率不高且明顯低于植物組，說明根際細(xì)菌的高效降解必須以海馬齒根系為依托.海馬齒根系和根際細(xì)菌的協(xié)同作用使得蛋白質(zhì)的降解效率明顯提高，其原因一方面可能是植物可以通過根系將氧氣釋放進(jìn)入水體，保證微生物有充足的氧氣對蛋白質(zhì)進(jìn)行降解.另一方面是根系分泌物可以改變根系周圍環(huán)境的pH值［31］、可能為微生物提供共代謝的底物［32－33］.許多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，向土壤中添加根系分泌物同樣能刺激微生物的活性.Abdel－Nasser［34］證實(shí)向土壤中添加人工合成的大麥根系分泌物可以刺激土壤中放線菌、真菌和細(xì)菌的數(shù)量.向土壤中添加燕麥的根系分泌物可以促進(jìn)菲的降解［35］，而向土壤中添加玉米的根系分泌物可以顯著提高14C－芘的礦化率［36］.由此可以看出根系分泌物在有機(jī)物根際降解中的重要作用.

4 結(jié) 論

1）本研究的不抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海馬齒的根際微生物具有降解蛋白質(zhì)的能力，其降解效率在有植物根系存在時明顯高于無根系時的降解效率，說明植物根系對于根際微生物降解蛋白質(zhì)有重要促進(jìn)作用.

2）抑菌實(shí)驗(yàn)表明氨芐霉素－頭孢噻肟－萬古霉素的抗生素組合能有效抑制海馬齒根際微生物的生長.在有效抑菌的情況下，整個實(shí)驗(yàn)過程中，植物組與細(xì)菌組都未檢測到亮氨酸氨基肽酶的活性，說明能高效降解可溶性蛋白質(zhì)的亮氨酸氨基肽酶完全來源于根際微生物，而非由海馬齒根系所分泌.

3）以上表明，在可溶性蛋白質(zhì)的根際降解中，根際細(xì)菌是降解的執(zhí)行者，但是根際細(xì)菌的高效降解是以植物根系為依托的，植物根系和根際細(xì)菌構(gòu)成互惠共生的關(guān)系.這為更好利用海馬齒生態(tài)浮床修復(fù)富含有機(jī)氮的海水環(huán)境提供了理論依據(jù).

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