蔡明夷，周 鵬，韓坤煌，謝芳靖，張子平，王藝?yán)冢?/p>

（1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361021；2.福建省國家級大黃魚原種場，寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司，福建 寧德352103；3.美國西東大學(xué)生物學(xué)系，新澤西州 南奧蘭治07090）

魚類的卵子發(fā)生通常要經(jīng)歷減數(shù)分裂的中斷、暫停與再啟動等步驟，而精子發(fā)生則是一個(gè)減數(shù)分裂連續(xù)的過程.因而，魚類的性腺被認(rèn)為是研究減數(shù)分裂周期調(diào)控的理想模型［1］.許多基因參與了魚類配子發(fā)生減數(shù)分裂過程的調(diào)控.其中，成熟促進(jìn)因子（maturation promoting factor，MPF）是誘導(dǎo)減數(shù)分裂暫停的卵子重新進(jìn)入成熟過程的關(guān)鍵因子［2］.MPF包括2個(gè)亞基：調(diào)節(jié)亞基細(xì)胞周期蛋白B（cyclin B，CB）和周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin－dependent kinase 1，CDK1，由cdc2基因編碼）［3］.CB和CDK1結(jié)合形成 MPF前體，經(jīng)過磷酸化／去磷酸化作用成為具有活性的MPF.活化的MPF可以催化一系列靶蛋白的磷酸化，誘導(dǎo)G2期向M期轉(zhuǎn)換；在卵子發(fā)生過程中，則誘導(dǎo)發(fā)生卵泡破裂（GVBD）、停滯減數(shù)分裂啟動等細(xì)胞行為的發(fā)生［4－6］.現(xiàn)有研究資料表明，MPF的有序表達(dá)、活化及降解是保證兩性生殖生物配子發(fā)生、成熟與分化等生物過程有序進(jìn)行的重要條件［7］.

大黃魚（Larimichthys crocea）是我國特有海水魚類，也是最重要的海水養(yǎng)殖魚類之一［8］.其生長具有明顯的雌雄二態(tài)性，雌性生長速度明顯快于雄性［9］.研究大黃魚性腺發(fā)育與性別分化分子機(jī)制，可為開發(fā)高效大黃魚性別控制方法、提高大黃魚生殖控制技術(shù)水平奠定基礎(chǔ).然而，目前關(guān)于大黃魚性腺發(fā)育和配子發(fā)生的知識主要集中于細(xì)胞水平［10－13］，分子水平的研究才剛剛起步，研究報(bào)道較少［14－15］.因此，本研究利用cDNA 末端快速擴(kuò)增法（rapid－amplification of cDNA ends，RACE）克隆了大黃魚cyclin B1 基因（Lc－cb1）和cdc2 基因（Lccdc2）的cDNA序列，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）技術(shù)分析了這2個(gè)基因在大黃魚性腺及其他組織的mRNA水平，為解析MPF在大黃魚性腺發(fā)育以及配子發(fā)生中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料收集

實(shí)驗(yàn)大黃魚取自寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司，雌雄各5尾，魚體質(zhì)量（524.7±118.2）g.活魚尾椎取血后迅速解剖取精巢、卵巢、肌肉、肝臟、腦、腎臟等組織，立即放入液氮速凍，取出置－80℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2 總RNA的提取和cDNA合成

按Zhang等［16］描述的方法從組織中提取總RNA，然后用DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ）37℃處理30 min，去除可能混雜的基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性.按照SMART－RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒說明書（Clontech，美國）所描述的方法，以3μg 總 RNA 為模板、Oligo（dT）為引物，并在SMARTⅡOligo的介導(dǎo)下，利用 M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶（Promega，上海）在37℃下反應(yīng)90min，合成RACE適用的cDNA第1鏈.合成產(chǎn)物在70℃下處理15 min滅活酶，然后貯存于－20℃冰箱中備用.

1.3 Lc－cb1 和Lc－cdc2 cDNA的克隆與測序

利用SMART－RACE方法獲得Lc－cb1 和Lc－cdc2 cDNA 5′端和3′端擴(kuò)增產(chǎn)物.第1輪擴(kuò)增以cDNA第1條鏈為模板，正反向引物分別為基因特異外引物（GSP）和通用引物組合（UPM）；第2輪擴(kuò)增的模板為第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物，正反向引物為GSP內(nèi)引物和巢式通用引物（NUP）.其中，GSP內(nèi)引物和外引物是基于前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的EST數(shù)據(jù)庫中的Lc－cb1和Lc－cdc2 cDNA部 分 序 列［17］、采 用 Primer 5.0 軟 件 設(shè) 計(jì) 的 （表1）.UPM 和 NUP 序列參見SMARTer RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒說明書（Clontech，美國）.25μL PCR反應(yīng)體系包括：0.5μL 模板 DNA，0.5μL 10mmol／L GSP，2.5μL 10mmol／L UPM（或 NUP），2.5μL 10×PCR 緩沖液，0.5μL 10mmol／L dNTP 混合液，0.5μL Taq DNA聚合酶和18μL雙蒸水.PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；然后95℃ 變性30s，60～68℃（詳見表1）退火30s，72℃90s，32個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10min.

上述第2輪PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳后，目標(biāo)片段經(jīng)回收純化，克隆到pMD18－T質(zhì)粒（Takara，日本），進(jìn)一步轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）JM109并增殖.從陽性克隆中分離質(zhì)粒，送上海捷瑞生物工程有限公司測序.序列結(jié)果用VecScreen（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／VecScreen／VecScreen.html）去除載體序列，再用 BLAST2（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／bl2seq／wblast2.cgi）比對拼接出cDNA全長序列.

1.4 qRT－PCR

大黃魚精巢、卵巢、肌肉、血、脾、肝、腎和腦等8個(gè)組織的樣品用于qRT－PCR，β－actin為內(nèi)參基因，以檢查Lc－cb1 和Lc－cdc2 mRNA 組織表達(dá)特征.反應(yīng)體系包括：cDNA 第1鏈9μL，10mmol／L qRT－PCR正反向引物各0.5μL（表1），SYBR Green Realtime PCRMaster Mix（Life Technology，美國）10μL.反應(yīng)體系混勻后，在ABI 7500PCR儀器上完成熱循環(huán)反應(yīng)和熒光檢測.PCR反應(yīng)條件為：50℃保溫2min，95℃變性1min；95℃變性15s、60℃退火1min，重復(fù)循環(huán)40次.每種組織檢測了取自不同個(gè)體的4個(gè)樣品，每個(gè)樣品做4次重復(fù).

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

mRNA表達(dá)水平用相對定量（relative quantification，RQ）平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示.mRNA表達(dá)量平均值的組織間差異的顯著性，用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件的Bonferroni模型作多重比較進(jìn)行單因素方差分析，p＜0.05為差異顯著.

1.5 基因序列的生物信息學(xué)分析

推導(dǎo)的氨基酸序列的比對和保守區(qū)域結(jié)構(gòu)比較利用GenBank網(wǎng)站的BLAST算法（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）在線完成.蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)預(yù)測利用 Compute pl／Mw tool（http：∥ca.expasy.org／tools／pi＿tool.html）完成.用InterProScan軟件4.8（ftp：∥ftp.ebi.ac.uk／pub／software／unix／iprscan／index.html）分析氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域.氨基酸序列的多重比較利用BioEdit軟件（http：∥www.mbio.ncsu.edu／BioEdit／bioedit.html）完成.蛋白進(jìn)化樹利用 Mega 5.1軟件（http：∥www.megasoftware.net／）的鄰接算法構(gòu)建.

2 結(jié) 果

2.1 Lc－cb1 和Lc－cdc2 cDNA序列特征

將3′RACE獲得片段、5′RACE獲得片段和文庫插入cDNA片段以BLAST 2軟件進(jìn)行序列拼接后，獲得Lc－cb1 基因的全長cDNA 序列1 882bp（Gen－Bank登錄號FJ195327），如圖1.其中，編碼區(qū)（ORF）長度為1 194bp，可編碼397個(gè)氨基酸的蛋白.5′－非翻譯區(qū)（UTR）長度為63bp；3′－UTR的長度為580bp（去除poly A），含有2個(gè)加尾信號（AUUAAA），和4個(gè)多聚腺苷酸化元件（cytoplasmic polyadenylation elements，簡稱為 CPEs；A／UUUUUAU／A）.推導(dǎo)的LC－CB1蛋白預(yù)測分子質(zhì)量約為44.56ku，等電點(diǎn)約為8.76，序列中含有一個(gè)典型的周期蛋白盒（166～313aa），其中272～276aa為CB特有的蛋白酶K位點(diǎn)（RRxSK），N端附近有一個(gè)周期蛋白A和CB共有的毀壞盒（RxALGxIxN，32～40aa）.氨基酸序列同源性比較結(jié)果顯示，該序列與爪哇青鳉（Oryzias javan－icus，84%）、青 鳉 （Oryzias latipes，83%）、斑 馬 魚（Danio rerio，67%）、非 洲 爪 蟾 （Xenopus laevis，64%）、小鼠（Mus musculus，61%）、智人（Homo sapiens，63%）等動物的CB1均有較高的同源性.

將3′RACE獲得片段、5′RACE獲得片段和文庫插入cDNA片段以BLAST 2軟件進(jìn)行序列拼接后，獲得Lc－cdc2基因全長cDNA序列 1 151bp（GenBank登錄號 FJ800565），如圖2.其中，ORF長度為 912bp，5′－UTR長度為72bp，3′－UTR的長度為150bp（去除poly A）.在poly A上游21bp處有一個(gè)典型的加尾信號（AATAAA ）.Lc－cdc2 cDNA 可編碼303個(gè)氨基酸的蛋白，預(yù)測分子質(zhì)量約為34.58ku，等電點(diǎn)約為8.80.推導(dǎo)的蛋白序列中包含一個(gè)CDK1典型的絲氨酸／蘇氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域（4～287aa），內(nèi)含絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)（124～136aa）、與ATP結(jié)合相關(guān)的保守序列GxGxxGxV（11～17aa）、與周期蛋白結(jié)合相關(guān)的保守序列PSTAIRE（45～51aa）等.氨基酸序列同源性比較結(jié)果顯示，該序列與龜殼攀鱸（Anabas testudineus，97%）、爪哇青鳉（95%）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss，95%）、斑馬魚（90%）、大西洋鮭（Salmo salar，88%）、胡瓜魚（Osmerus mordax，92%）、金魚（Carassius auratus，90%）、非洲爪蟾（85%）、褐家鼠（Rattus norvegicus，81%）和智人（82%）等物種的CDK1均有較高的同源性.

2.2 同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

將推導(dǎo)的LC－CB1氨基酸序列與爪哇青鳉（登錄號Q9DGA0）、斑馬魚（登錄號 BAA92876）、青鳉（登錄號Q9IBG1）、非洲爪蟾（登錄號 AAH41302）、智人（登錄號P14635）和小鼠（登錄號CAA45968）等6個(gè)物種的CB1氨基酸序列進(jìn)行多序列比對.結(jié)果表明，大黃魚及其他6個(gè)物種都具有CB1特征結(jié)構(gòu)域（詳見圖3）.根據(jù)Lc－cb1 cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列與上述6個(gè)物種的CB1氨基酸序列一致性在46%～84%之間，N端近中部的氨基酸序列變化較大，其他區(qū)域的保守性較高.

將推導(dǎo)的大黃魚CDK1氨基酸序列與爪哇青鳉（登錄號BAB17220）、龜殼攀鱸（登錄號AAS59851）、胡瓜魚（登錄號 AC0008896）、大西洋鮭（登錄號 NP 001134623）、虹鱒（登錄號 NP 001118132）、金魚 （登錄號AFV07384）、斑馬魚（登錄號 NP 997729）、非洲爪蟾（登 錄 號 NP 001080093）、鴨 嘴 獸 （Ornithorhynchus anatinus，登 錄 號 XP 001509674）、原 雞 （Gallus gallus，登 錄 號 NP 990645）、智 人 （登 錄 號 NP 001777）、褐家鼠（登錄號 NP 062169）和果蠅（Drosophila melanogaster，登錄號 NP 476797）等13個(gè)物種CDK1氨基酸序列進(jìn)行多序列比對.結(jié)果表明，大黃魚CDK1與其他13個(gè)物種一樣，都具有CDK1特征結(jié)構(gòu)域（詳見圖4）.根據(jù)Lc－cdc2 cDNA序列推導(dǎo)的氨基酸序列與上述的6種魚類的CDK1氨基酸序列一致性在88%～95%之間，與果蠅的CDK1氨基酸序列一致性也有71%.

圖1 Lc－cb1 cDNA全長及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and deduced amino acid sequences of Lc－cb1 cDNA

通過鄰接法構(gòu)建的CB系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5（a））顯示，大黃魚CB1與青鳉、爪哇青鳉和斑馬魚等魚類的CB1首先聚在一個(gè)小枝上，再與非洲爪蟾、小鼠和智人等其他脊椎動物CB1所聚的一小枝聚為一個(gè)較大分枝；與斑馬魚、非洲爪蟾、小鼠和智人等物種的CB2關(guān)系較遠(yuǎn)，與麗新桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的CB3的關(guān)系更遠(yuǎn).通過鄰接法構(gòu)建的CDK1系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5（b））顯示，大黃魚首先與龜殼攀鱸聚為一枝，并與爪哇青鳉等其他6種魚類聚為一個(gè)二級分枝；其他5種非魚類脊椎動物聚為另一個(gè)二級分枝；果蠅這種無脊椎動物的CDK1與其他13種脊椎動物距離最遠(yuǎn).

圖2 Lc－cdc2基因cDNA全長及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and deduced amino acid sequences of Lc－cdc2 cDNA

2.3 Lc－cb1 和Lc－cdc2 基因在大黃魚各器官中的表達(dá)

qRT－PCR分析大黃魚不同組織中Lc－cb1和Lccdc2基因mRNA水平如圖6所示.Lc－cb1和Lc－cdc2基因在大黃魚各組織均有表達(dá).2個(gè)基因的表達(dá)組織譜具有相似特征，并呈現(xiàn)出較強(qiáng)的組織特異性：在卵巢的表達(dá)量均為最多，在精巢的表達(dá)量次之，其他組織僅有微量表達(dá)，表達(dá)量最少的是腦組織.Lc－cb1卵巢表達(dá)量約為腦表達(dá)量的2 145倍，Lc－cdc2卵巢表達(dá)量約為腦表達(dá)量的349倍.

3 討 論

圖3 大黃魚及其他物種CB1氨基酸序列的多重比較Fig.3 Multiple alignment of the CB1amino acid sequence between L.croaker and other species

本研究獲得了大黃魚 Lc－cb1 和Lc－cdc2 cDNA全長，GenBank登錄號分別為FJ195327和FJ800565.根據(jù)所獲得的 Lc－cb1 cDNA 序列（FJ195327）推導(dǎo)的氨基酸序列與其他已登錄GenBank的魚類的CB1氨基酸序列有較高相似性（67%～84%），具有周期蛋白家族的特征，如周期蛋白盒和RxALGxIxN序列；周期蛋白A和CB所特有的毀壞盒以及CB特征的蛋白酶K位點(diǎn).本研究獲得的Lc－cdc2 cDNA （FJ800565）推測的氨基酸序列與其他已登錄GenBank的魚類的CB1氨基酸序列也有較高相似性（88%～97%），且具有CDK1的特征序列，如絲氨酸／蘇氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域、ATP結(jié)合相關(guān)的保守序列GxGxxGxV和與周期蛋白結(jié)合相關(guān)的保守序列PSTAIRE等.可見，生物信息學(xué)分析結(jié)果證明，本研究所獲得的2條序列分別具備了cb1和cdc2基因cDNA的基本特征.

CB是MPF的調(diào)節(jié)亞基.脊椎動物中，涉及M期調(diào)控的周期蛋白主要有4種亞型.各亞型的分布和功能存在差異.例如，在智人培養(yǎng)細(xì)胞中，CB1定位在微管，CB2主要分布在高爾基器上［18］.在非洲爪蟾卵子中，CB2在第一次減數(shù)分裂雙極紡錘體的形成中發(fā)揮作用［19－20］.小鼠中，CB1是胚胎發(fā)育和性腺發(fā)育的關(guān)鍵基因并能夠補(bǔ)償CB2的缺失［21］.在雞10日齡胚胎中，CB3兼具周期蛋白A和CB的特點(diǎn)，既能與CDK1也能與CDK2聯(lián)合作用［22］.本研究基于氨基酸序列比對，構(gòu)建了CB進(jìn)化樹.結(jié)果表明，大黃魚CB1與其他魚類CB1關(guān)系最近；與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的哺乳動物（如智人類和小鼠）CB1的關(guān)系要近于與近緣種（如斑馬魚）CB2的關(guān)系.這與虹鱒、青鳉、日本鰻鱺（Anguilla japonica）等其他魚類中得到的結(jié)果一致［23－25］.CB 的mRNA通常有一條較長的3′－UTR，例如智人（NM031966）cb1 mRNA 3′－UTR 的長度為615bp.3′－UTR可能通過影響mRNA的多聚腺苷化／去腺苷化、翻譯效率、翻譯定位和mRNA穩(wěn)定性來實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控.cb1 3′－UTR上含有參與mRNA翻譯調(diào)控的順式元件，其中研究最為深入的是CPE元件.CPE為富含U的序列（A／UUUUUAU／A），在卵子成熟過程中通過幫助聯(lián)接加尾信號活化CB的翻譯［26］.在卵子中顯微注射CPE能夠誘導(dǎo)CB1蛋白合成［27］.Lccb1 mRNA 3′－UTR長度為580bp，初步分析發(fā)現(xiàn)其中含有4個(gè)CPE元件、多個(gè)富U類的CPE序列和2個(gè)加尾信號，與斑馬魚、非洲爪蟾、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）等生物cb1 3′－UTR 結(jié)構(gòu)基本相似，但CPE元件的數(shù)目和分布在不同物種間有所變化.cb1 mRNA 3′－UTR的總體結(jié)構(gòu)、CPE元件的數(shù)目和分布均可能影響翻譯效率，并可能與生物的具體功能需求相關(guān)［28］.

圖4 大黃魚及其他物種CDK1氨基酸序列的多重比較Fig.4 Multiple alignment of the CDK1amino acid sequence between L.croaker and other species

圖5 基于大黃魚和其他物種的CB1（a）和CDK1（b）氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of CB1（a）and CDK1（b）between L.crocea and other species

圖6 大黃點(diǎn)Lc－cb1（a）和Lc－cdc2（b）mRNA的組織表達(dá)圖譜Fig.6 Tissue expression profiles of Lc－cb1（a）and Lc－cdc2（b）mRNA transcripts in L.crocea

CDK1是一個(gè)高度保守的小蛋白，分子質(zhì)量約34 ku.CDK1參與了細(xì)胞周期的全部進(jìn)程，如細(xì)胞周期啟動、從G1期向S期轉(zhuǎn)換、從S期向G2期轉(zhuǎn)換，以及G2期向M期轉(zhuǎn)換等.CDK1能夠有序行使功能主要依靠三方面的調(diào)控：調(diào)節(jié)亞基周期蛋白的結(jié)合、保守殘基的磷酸化、以及CDK抑制物（CKI）結(jié)合.調(diào)節(jié)亞基周期蛋白的類型，通過影響CDK1活性位點(diǎn)的位置與結(jié)構(gòu)，決定周期蛋白－CDK復(fù)合物的適合底物和特殊功能［29］.其中，CB1－CDK1復(fù)合物主要調(diào)控 G2期向M期轉(zhuǎn)換過程.CB1和CDK1結(jié)合形成MPF前體，需要活化才能行使功能.在魚類卵子成熟過程中，目前已發(fā)現(xiàn)2種形式的MPF活化機(jī)制.在第1種機(jī)制中，CB1在即將發(fā)生GVBD時(shí)，在激素作用下開始合成，并立即與CDK1結(jié)合形成MPF前體；之后通過CDK1上Thr161的磷酸化，即可完成MPF的活化，如金魚［5］.在第2種機(jī)制中，未成熟卵子已存在完整的MPF前體，MPF的活化既需要磷酸化，還需要CDC25催化的去磷酸化作用，如龜殼攀鱸［30］.基于氨基酸序列的進(jìn)化樹顯示，大黃魚與龜殼攀鱸的CDK1相似性最高（圖5（b））.那么，大黃魚MPF的活化機(jī)制是否與龜殼攀鱸一致，MPF的活化機(jī)制的分化是否與物種的分化相符，尚需要進(jìn)一步研究.

qRT－PCR分析結(jié)果顯示，Lc－cb1 和Lc－cdc2 mRNA表達(dá)具有較強(qiáng)的組織特異性，性腺中Lc－cb1和Lc－cdc2 mRNA水平極顯著地高于其他組織.這與前人在虹鱒、青鳉和鋸緣青蟹等生物中觀察到的結(jié)果一致［23－24，31］.CB1和CDK1組成的MPF是細(xì)胞周期調(diào)控因子，Lc－cb1和Lc－cdc2在大黃魚性腺中高水平表達(dá)，與性腺中有絲分裂和減數(shù)分裂活動活躍的特點(diǎn)相符合.

4 結(jié) 論

大黃魚是我國最重要的海水魚類.本研究克隆大黃魚Lc－cb1和Lc－cdc2基因全長cDNA序列，并分析了這2條序列及推測蛋白序列特征，發(fā)現(xiàn)大黃魚與龜殼攀鱸CDK1序列的相似性高達(dá)97%；同時(shí)，研究還揭示大黃魚中Lc－cb1和Lc－cdc2 mRNA的表達(dá)具有不嚴(yán)格的組織特異性，在性腺中優(yōu)勢表達(dá)，表明MPF在大黃魚性腺發(fā)育以及配子發(fā)生中具有重要作用.本文研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示MPF在大黃魚性腺發(fā)育以及配子發(fā)生中的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ).

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