褐藻多糖硫酸酯對脂多糖誘導大鼠腎小球系膜細胞 NO產(chǎn)生量的影響

王雪妹 , 王 晶 張全斌

(1. 中國科學院 海洋研究所 海洋生物技術(shù)工程研究發(fā)展中心, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院大學, 北京100049)

褐藻多糖硫酸酯是來源于褐藻細胞壁的一種主要由硫酸化的巖藻糖組成的結(jié)構(gòu)復雜多變的雜多糖。褐藻多糖硫酸酯具有多種生物活性, 主要有抗病毒、抗腫瘤、抗凝血和抗血栓、抗炎癥和增強機體免疫功能等, 且隨著他們的化學組分不盡相同, 其生物活性也有很大差異[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2], 褐藻多糖硫酸酯在動物腎臟損傷模型中具有很好的腎臟保護作用, 可緩解慢性腎衰, 且已在臨床得到了應用。褐藻多糖硫酸酯在慢性腎衰中對腎臟的保護作用表現(xiàn)在可降低尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平, 改善腎臟功能[3]。對于褐藻多糖硫酸酯抗腎衰的機制已有一些研究, 褐藻多糖硫酸酯對腎臟的保護作用與其抗氧化能力相關(guān)[3], 褐藻多糖硫酸酯可抑制阿霉素腎病腎硬化大鼠腎臟中TGF-β1表達, 并減少細胞外基質(zhì)中Ⅳ型膠原蛋白和纖連蛋白的合成[4], 褐藻多糖硫酸酯可抑制腎小管上皮細胞間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化[5]。但是褐藻多糖硫酸酯抗腎衰的機制尚不明確, 有待進一步的研究。

NO是哺乳動物體內(nèi)一種重要的信號分子, 與機體的炎癥反應密切相關(guān)。LPS是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分, 對宿主是有毒性的, 是一種細菌內(nèi)毒素。LPS可誘導人腎小球系膜細胞的炎癥反應, 包括 NO含量的增加[6]。研究證明, 分子質(zhì)量對多糖活性有重要影響, 本研究制備了兩種不同分子質(zhì)量褐藻多糖硫酸酯, 選取大鼠腎小球系膜細胞作為實驗材料, 以 LPS誘導炎癥反應作為模型, 探討不同分子質(zhì)量褐藻多糖硫酸酯是否能夠抑制LPS誘導的細胞培養(yǎng)液中 NO含量的增加, 從而抑制細胞的炎癥反應。通過實驗結(jié)果探究褐藻多糖硫酸酯抗炎效果與其分子質(zhì)量之間的關(guān)系, 從而對不同分子質(zhì)量的褐藻多糖硫酸酯抗腎衰效果的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞

大鼠腎小球系膜細胞(HBZY-1)購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Colle-ction, CCTCC)。

1.1.2 實驗藥物

從海帶(Laminaria japonica)中提取褐藻多糖硫酸酯[7], 標記為F1。由F1降解得到低分子質(zhì)量褐藻多糖硫酸酯[8], 標記為F2。

1.1.3 實驗試劑

DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)高糖(4500 mg/L Glucose)培養(yǎng)基(Hyclone公司); 胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS, Hyclone公司); 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS, 美國Sigma公司); 胰蛋白酶(含 EDTA, Solarbio公司); MTT(美國 Sigma公司); 一氧化氮檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 褐藻多糖硫酸酯化學組成的測定

褐藻多糖硫酸酯分子質(zhì)量用高效凝膠色譜法以葡聚糖作為分子質(zhì)量標準進行測定。巖藻糖含量用半胱氨酸鹽酸鹽法(Gibbons法)以巖藻糖為標準進行測定[9]。硫酸根含量用明膠氯化鋇法以硫酸鉀為標準進行測定[10]。糖醛酸含量用咔唑比色法以葡萄糖醛酸為標準進行測定[11]。單糖含量組成用PMP柱前衍生-HPLC法進行測定[12]。

1.2.2 大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1的培養(yǎng)

大鼠腎小球系膜細胞 HBZY-1的培養(yǎng)條件為:90%DMEM高糖培養(yǎng)基, 10%胎牛血清, 青鏈霉素混合液(青霉素的工作濃度為100 U/mL, 鏈霉素的工作濃度為0.1 g/L), 37℃, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時間為2 d, 消化液為含0.25%EDTA的胰蛋白酶溶液。

1.2.3 MTT法測定細胞活力

待細胞生長至對數(shù)期時, 消化收集細胞, 調(diào)整細胞懸液的濃度, 使細胞濃度為5×104個/mL。鋪96孔板, 每孔加入100 μL細胞懸液, 細胞數(shù)目為5×103個/孔。過夜培養(yǎng)至細胞貼壁, 換0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)基, 培養(yǎng)24 h, 使細胞處于G0期。換10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基, 正常組和模型組不加任何藥物, 藥物組加入藥物F1或F2使其終濃度為12.5、25、50、100 mg/L, 處理1 h后, 模型組和藥物組加入LPS使其終濃度為 0.5 mg/L, 繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。每孔加入20 μL 5g/L MTT(避光), 培養(yǎng) 4 h。吸去培養(yǎng)液, 每孔加入 150μL DMSO, 低速搖床振蕩 10 min, 酶標儀490 nm測各孔吸光值。

1.2.4 細胞培養(yǎng)液中NO含量的測定

待細胞生長至對數(shù)期時, 消化收集細胞, 調(diào)整細胞懸液的濃度, 使細胞濃度為3×104個/mL。鋪24孔板, 每孔加入 1 mL細胞懸液, 細胞數(shù)目為 3×104個/孔。過夜培養(yǎng)至細胞貼壁, 換0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)基, 培養(yǎng)24 h。換10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基, 正常組和模型組不加任何藥物, 藥物組加入藥物 F1 或 F2 使其終濃度為 12.5、25、50、100 mg/L, 處理 1 h后, 模型組和藥物組加入 LPS使其終濃度為0.5 mg/L。培養(yǎng)24 h, 取培養(yǎng)液200 μL, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h,取培養(yǎng)液200 μL, Griess法測培養(yǎng)液中NO含量。

用完全培養(yǎng)基稀釋標準品 NaNO2, 使標準品的濃度依次為 0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。按50 μL/孔, 在96孔板中加入樣品(設3個平行)及標準品, 在各孔中加入室溫Griess Reagent I 和Griess Reagent II 各 50 μL。10 min 后, 540 nm 測定吸光度。

1.2.5 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用(x±s)表示, 采用SPSS13.0進行成組間方差分析, P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 褐藻多糖硫酸酯化學組成測定結(jié)果

來源于海帶的褐藻多糖硫酸酯及其低分子質(zhì)量產(chǎn)物(F1和 F2)的化學組成測定結(jié)果見表 1。結(jié)果表明, F1的分子質(zhì)量為 87 305 Da, F2的分子質(zhì)量為6 500 Da, F1分子質(zhì)量明顯高于F2。F1和F2的主要化學成分均為巖藻糖和硫酸根, 另外均含有較多的半乳糖。F2與F1相比, F2巖藻糖和硫酸根含量略低于F1, 且F2含有較多的半乳糖。

2.2 MTT法測定細胞活力

MTT法測定各組細胞活力結(jié)果如圖 1(以 F2為例)所示。結(jié)果表明, 各組間細胞活力無顯著性差異。因此, 在此基礎(chǔ)上測定其他指標是可行的, 可排除因各組間細胞活力差異導致的其他指標的變化。

表1 來源于海帶的褐藻多糖硫酸酯(F1和F2)的化學組成Tab.1 Chemical composition of fucoidan (F1 and F2) from Laminaria japonica

圖1 MTT法測定各組細胞活力(以F2為例)Fig.1 The cell viability of each group detected by MTT method (taking F2 as the example)

2.3 細胞培養(yǎng)液中NO含量的測定

細胞培養(yǎng)液中NO含量測定結(jié)果見圖2及圖3。由圖2可知, F1可以抑制LPS引起的大鼠腎小球系膜細胞NO產(chǎn)生量的增加, 24 h時, 25、50、100 mg/L三個藥物組與模型組相比 NO含量有顯著性差異,48 h時, 12.5、25、50、100 mg/L四個藥物組與模型組相比NO含量均有顯著性差異。由圖3可知, F2可以抑制LPS引起的大鼠腎小球系膜細胞NO產(chǎn)生量的增加, 24 h時, 50、100 mg/L兩個藥物組與模型組相比NO含量有顯著性差異, 48 h時, 12.5、25、50、100 mg/L四個藥物組與模型組相比NO含量均有顯著性差異。

圖2 F1對LPS誘導HBZY-1 NO產(chǎn)生量的影響(24 h和48 h)Fig.2 The effect of F2 on NO production by HBZY-1 cells induced by LPS (24 h and 48 h)

圖3 F2對LPS誘導HBZY-1 NO產(chǎn)生量的影響(24 h和48 h)Fig.3 The effect of F2 on NO production by HBZY-1 cells induced by LPS (24 h and 48 h)

為了比較F1和F2抑制LPS誘導大鼠腎小球系膜細胞 NO產(chǎn)生的效果大小, 選取作用時間為 48h,藥物濃度為 25 mg/L的組別與對應的模型組進行比較, 結(jié)果如表2所示。由表2可知, F1和F2的作用劑量為 25 mg/L時, 與模型組相比, 細胞培養(yǎng)液中NO含量下降比例分別為 22.52%和 38.65%, 藥物抗炎效果為F2>F1。

表2 F1和F2抑制LPS誘導大鼠腎小球系膜細胞NO產(chǎn)生的效果比較Tab.2 Comparison of inhibitory effect of F1 and F2 on NO production induced by LPS

3 討論

褐藻多糖硫酸酯具有抗炎和抗腎衰的活性, 且其抗腎衰活性已在臨床的得到了應用。雖然對于褐藻多糖硫酸酯腎臟保護作用的機制有一定的研究,但是其腎臟保護機制尚不明確。在慢性腎衰的進程中伴隨著炎癥反應的發(fā)生, 研究褐藻多糖硫酸酯抗炎作用對于褐藻多糖硫酸酯抗腎衰效果及機制的研究具有一定的意義。腎小球系膜細胞是腎臟中三種固有細胞之一, 對于腎臟炎癥、慢性腎衰的進程中起到重要的作用。本文研究結(jié)果表明, LPS可引起大鼠腎小球系膜細胞NO產(chǎn)量的增加, F1和F2均可在一定程度上抑制細胞的 NO的產(chǎn)生, 從而降低細胞的炎癥反應。

由F1和F2化學組成及其抑制LPS誘導的大鼠腎小球系膜細胞 NO產(chǎn)生的效果可知, F2抗炎作用(NO含量降低比例為 38.65%)顯著高于 F1(22.52%),且 F2分子質(zhì)量(6 500 Da)明顯低于 F1(87 305 Da),由此可推斷分子量較低時抗炎效果更好, 可能是由于分子量較低時更易被細胞吸收, 從而更易起到抗炎的作用。在以后的研究工作中, 可通過研究不同化學組成的褐藻多糖硫酸酯的抗腎衰效果, 通過對褐藻多糖硫酸酯抗腎衰效果與抗炎效果進行比較, 從而確定褐藻多糖硫酸酯抗腎衰是否與其具有抗炎作用有一定的關(guān)系。

NO是以精氨酸作為底物在NO合酶的作用下生成的, 在部分炎癥反應中, 會有NO合酶含量的升高從而導致NO生成量的增加。因此, 褐藻多糖硫酸酯可能通過某種方式影響 NO合酶的含量或活性, 從而對 NO的產(chǎn)生過程產(chǎn)生一定的影響。為了探究褐藻多糖硫酸酯影響 NO產(chǎn)生的原因和途徑, 在接下來的研究工作中, 可通過研究 NO合成酶含量的變化來探究褐藻多糖硫酸酯對于 NO含量產(chǎn)生影響的途徑。

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