金 濤，梁廣文，曾 玲*，陸永躍*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)研究室，廣州 510642;2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，?？?571101)

桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis (Hendel)，屬雙翅目Diptera，實(shí)蠅科Tephritidae，寡毛實(shí)蠅亞科Dacinae，是我國(guó)和許多國(guó)家重要害蟲。桔小實(shí)蠅生活周期短、繁殖力強(qiáng)，寄主范圍廣，可為害番石榴、楊桃、芒果等46 個(gè)科250 多種水果、蔬菜和花卉，是一種危害性大的害蟲(Bateman，1972;Allwood et al.，1999)。近年來，在我國(guó)發(fā)現(xiàn)該蟲有不斷向長(zhǎng)江流域地區(qū)擴(kuò)散的趨勢(shì) (范京安，1998;蔣小龍等，2001;侯柏華和張潤(rùn)杰，2005;熊焰等，2006)。目前防治桔小實(shí)蠅還是以化學(xué)農(nóng)藥為主，輔以引誘劑和水果套袋技術(shù)。田間持續(xù)的化學(xué)防控已使得桔小實(shí)蠅抗藥性不斷增強(qiáng)(潘志萍等，2005;章玉蘋等，2007;章玉蘋等，2008;Jin et al.，2011)。室內(nèi)培育不同抗藥性品系的研究發(fā)現(xiàn)，桔小實(shí)蠅對(duì)敵百蟲、高效氯氰菊酯和阿維菌素抗性發(fā)展較快，汰選至14 代其抗性分別增長(zhǎng)至84.16 倍、27.1 倍和7.7 倍(潘志萍等，2008)。對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)已形成的對(duì)敵百蟲產(chǎn)生桔小實(shí)蠅高抗品系衰退再增長(zhǎng)的趨勢(shì)研究表明，桔小實(shí)蠅通過6至9 個(gè)世代的選育，抗性會(huì)迅速上升至原來水平(章玉蘋等，2008)?？剐栽鰪?qiáng)導(dǎo)致農(nóng)藥使用效率下降，加大了防治難度。對(duì)桔小實(shí)蠅抗藥性機(jī)制的研究有助于抗藥性治理和制定有效的防治策略，延緩抗性水平的上升。

昆蟲的抗藥性機(jī)制大致可分為行為躲避、代謝解毒能力增強(qiáng)和靶標(biāo)不敏感等類型。相關(guān)研究表明，與殺蟲劑代謝相關(guān)的解毒酶活性的增強(qiáng)是害蟲對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生抗性的主要生理標(biāo)志(劉澤文等，2002;張紅英等，2002;Liu，2003;張?jiān)伱返龋?006;劉永杰等，2007;van Pottelberge et al.，2008)。昆蟲解毒酶是一類異質(zhì)酶系，能夠結(jié)合代謝大量的內(nèi)源或外源底物，主要包括多功能氧化酶、羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等，不同的解毒酶對(duì)不同殺蟲劑的抗性發(fā)展作用不同(Oppenoorth，1965;Terriere，1984;劉澤文等，2002;張紅英等，2002)。其中，MFO 的底物譜極廣，幾乎能氧化代謝所有的殺蟲劑，與很多的害蟲抗藥性形成有關(guān)(周成理等，1993;陳之浩等，1993)。CarE 是昆蟲體內(nèi)重要的幾種酶之一，其高親和性-低能解毒作用的活力增強(qiáng)是昆蟲對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要機(jī)制(何林等，2003)。GST 是昆蟲體內(nèi)的一類與抗性有關(guān)的初級(jí)代謝及次級(jí)代謝酶系。該酶系能使有害的親電物質(zhì)與內(nèi)源的還原型谷胱甘肽結(jié)合，參與轉(zhuǎn)運(yùn)體內(nèi)重要的脂類化合物，能為谷胱甘肽的S原子提供電子催化親核反應(yīng)。該酶在一些昆蟲對(duì)有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類和有機(jī)氯類等傳統(tǒng)殺蟲劑的抗性中所起的作用很早以前就得到證實(shí)(Oppenoorth，1976)。作為與昆蟲抗性水平相關(guān)的這幾種解毒酶，其活性大小也會(huì)與對(duì)不同藥劑的抗性水平存在聯(lián)系。本文以具有不同抗性水平的桔小實(shí)蠅地理種群品系為材料，在測(cè)定了解毒酶的活性和抗性水平的基礎(chǔ)之上，比較了這幾種酶的活性和抗性水平關(guān)系，為尋找抗性監(jiān)測(cè)的生化指標(biāo)，明確桔小實(shí)蠅解毒酶活性與其抗性水平關(guān)系，進(jìn)行有效的桔小實(shí)蠅抗藥性治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源

相對(duì)敏感品系:桔小實(shí)蠅采集于廣東省廣州市楊桃公園。在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)研究室昆蟲飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，在室內(nèi)不接觸任何藥劑條件下，用人工飼料、香蕉等連續(xù)飼養(yǎng)繁殖33 代。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度26-30℃，光照周期L∶D=16∶8 h，相對(duì)濕度:75%-90%。藥膜法測(cè)定該品系對(duì)敵百蟲、高效氯氰菊酯和阿維菌素抗藥性程度為低抗性水平(致死中濃度均小于3 mg/L)。

地理種群品系:選定全國(guó)桔小實(shí)蠅主要發(fā)生為害區(qū)域。于2007年至2008年各地區(qū)水果成熟季，一次性采集各地區(qū)楊桃、番石榴、柑桔等落果，約挑出老熟的3 齡幼蟲約300 頭，使用人工飼料飼養(yǎng)至下一代，在室內(nèi)建立地理種群。

1.1.2 主要試劑及儀器

主要試劑:α-乙酸萘酯，化學(xué)純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;α-萘酚，分析純，上?；瘜W(xué)試劑公司;毒扁豆堿，生化試劑，F(xiàn)luka 公司;對(duì)硝基苯酚和對(duì)硝基苯甲醚，上海三愛思試劑有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、固藍(lán)B 鹽和考馬斯亮藍(lán)G-250，為Sigma 公司產(chǎn)品;還原性輔酶Ⅱ和牛血清蛋白(組分五)，Roche 試劑公司。丙酮、無(wú)水乙醇、Na2HPO3和NaH2PO3均為國(guó)產(chǎn)分析純。谷胱甘肽-S 轉(zhuǎn)移酶測(cè)試試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

主要儀器:751 型分光光度計(jì);Centrifuge 5810 冷凍高速離心機(jī);恒溫水浴鍋。

1.2 抗性水平的測(cè)定

從每個(gè)測(cè)定酶活的桔小實(shí)蠅相對(duì)敏感種群和地理種群中，選羽化后3-5 d 附肢齊全、行為活潑的成蟲供試。采用藥膜法測(cè)定不同地理種群桔小實(shí)蠅對(duì)敵百蟲(Trichlorphon)、高效氯氰菊酯(β-cypermethrin)和阿維菌素(Avermectin)抗性水平(潘志萍等，2005;Lin et al.，2013)。

應(yīng)用SPSS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(賈春生，2006)和EXCEL 表格分析軟件(張志祥等，2002)，計(jì)算出的致死中濃度(Lethal Concentration 50，LC50)及其95%置信度，抗性倍數(shù)(Resistance Multiple，RM)為供試種群的LC50與相對(duì)敏感種群的LC50的比值。

1.3 酶活測(cè)定方法

1.3.1 多功能氧化酶(MFO)-O-脫甲基活性測(cè)定

越秀說：“我們成親后，喬瞧姐就很少出門，也不替人看病了，看到她，跟她說話，她就當(dāng)沒聽見。她都二十五六了，還沒嫁人?！?/p>

在室內(nèi)飼養(yǎng)1代后，從各地理桔小實(shí)蠅種群中取5 頭羽化后3 至5 天后成蟲，置于冰浴的研缽中，加入少量的石英砂研磨后。加入0.1 m mol/L PH7.8 磷酸緩沖液1.2 mL，充分勻漿。在4℃，3600 rpm 離心15 min。取上清液作為酶源備用。每處理重復(fù)3 次。測(cè)定多功能氧化酶-O-脫甲基活性，參照Hung 等(Hung and Sun，1989)的方法并改進(jìn)。取0.5 mL 的酶液、1 mL 的1 m mol/L NADPH、0.1 mL 的0.1 m mol/L 對(duì)硝基苯甲醚。置于30℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，然后加1 mL 濃度為1 mmol/L HCl 終止反應(yīng)。再向試管中加入5 mL氯仿萃取，分層后在氯仿層移取3 mL 到另一試管內(nèi)，再加3 mL 的0.5 mol/L NaOH 萃取。取NaOH溶液層2 mL 于比色皿中，于400 nm 處測(cè)OD 值，根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶源的蛋白質(zhì)含量，將OD 值換算成比活力μmol· (mg·30 min)-1。

1.3.2 羧酸酯酶(CarE)活性測(cè)定

酶源制備方法基本同上，只是使用0.04 mmol/L PH7.0 磷酸緩沖液代替原來的PH7.8 的磷酸緩沖液作為提取液。參照van Asperen (Vail et al.，1980)的方法。取0.1 mL 的酶液和5 mL 的反應(yīng)底物(1 mL 的0.03 mol/L α-醋酸萘酯、1 mL 的3×10-4mmol/L 毒扁豆堿以及98 mL 的0.04 m mol/L PH 7.0 的磷酸緩沖液的混合物)混合后，再加入1 mL 顯色劑(5%十二烷基硫酸鈉溶液和1%的固藍(lán)B 鹽以5∶2 比例配制)?；靹蚝笫覝仂o置30 min，600 nm 下測(cè)OD 值。

1.3.3 谷胱甘肽-S 轉(zhuǎn)移酶(GST)活性測(cè)定

酶源制備方法基本同上，但使用ddH2O 代替磷酸緩沖液。使用南京建成工程研究所研制的谷胱甘肽-S 轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒。其原理為GST 具有催化還原谷胱甘肽(GSH)與1-氯-2，4-二硝基苯結(jié)合的能力，在一定反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，其活性的高低與反應(yīng)前后底物濃度的變化呈線性關(guān)系。因而通過檢測(cè)GSH 濃度的高低來反映GST 活力的大小，其GSH 濃度降低的越多則GST 的活力越大。相關(guān)操作過程參照試劑盒說明書。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照 Bradford 考馬斯亮藍(lán) G-250 方法(Bradford，1976)。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 相關(guān)分析及通徑分析方法

以3種測(cè)定酶活性測(cè)定值與相對(duì)敏感品系酶活性平均值的比值和地理品系對(duì)3種殺蟲劑的抗性水平作相關(guān)性分析，并進(jìn)行通經(jīng)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SAS 9.0 數(shù)據(jù)處理軟件和EXCEL 表格軟件分析、處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔小實(shí)蠅各地理品系對(duì)三種殺蟲劑的抗性水平

桔小實(shí)蠅各地理品系對(duì)敵百蟲、高效氯氰菊酯和阿維菌素的抗性情況如表1 所示。廣東茂名桔小實(shí)蠅種群對(duì)敵百蟲的抗性水平最高，是相對(duì)敏感品系的100.2271 倍，處于高抗水平。廣東惠州地區(qū)桔小實(shí)蠅種群對(duì)敵百蟲的抗性水平最低，只有相對(duì)敏感品系的2.1552 倍。各地區(qū)桔小實(shí)蠅品系對(duì)高效氯氰菊酯的抗性水平在1.0065 到26.0026 倍之間?？剐运奖容^發(fā)現(xiàn)，部分地區(qū)抗性倍數(shù)之間存在顯著差異，如廣州明顯高于福州。云南元江桔小實(shí)蠅對(duì)高效氯氰菊酯抗性水平最低，只有相對(duì)敏感品系的1.0065 倍，明顯低于其他地區(qū)。各地區(qū)桔小實(shí)蠅對(duì)阿維菌素的抗性倍數(shù)在2.3353 至29.0688 倍之間，以茂名的最高，南寧的最低。

2.2 桔小實(shí)蠅不同品系的幾種酶活性

各地區(qū)桔小實(shí)蠅成蟲的MFO-O-脫甲基活性見表2。廣州和無(wú)錫桔小實(shí)蠅體內(nèi)的酶活性最高，分別為相對(duì)敏感品系的1.4782 和1.4641 倍;而茂名品系的酶比活性最低，只有相對(duì)敏感品系的0.8649 倍;其它各地區(qū)桔小實(shí)蠅品系酶活性比值在0.9603 和1.2950 之間。

2.2.2 桔小實(shí)蠅不同品系的羧酸酯酶 (CarE)活性

桔小實(shí)蠅不同地理品系的成蟲CarE 活性測(cè)定結(jié)果表明廣東惠州桔小實(shí)蠅種群最高，為相對(duì)敏感品系的1.8147 倍;廣西南寧的桔小實(shí)蠅酶活性最低，只有相對(duì)敏感品系的0.9636 倍;其它各地區(qū)桔小實(shí)蠅品系酶活性與相對(duì)敏感品系酶活性比值在1.1018 和1.3995 之間。9 個(gè)桔小實(shí)蠅的地理種群CarE 活性變化幅度較小，表明了CarE 活性水平較為穩(wěn)定(表3)。

表1 各地區(qū)桔小實(shí)蠅品系和相對(duì)敏感品系的抗性倍數(shù)Table 1 Resistance folds in different populations and sensitive strains of Bactrocera dorsalis

表2 桔小實(shí)蠅地理種群的多功能氧化酶-O-脫甲基活性Table 2 Activity of MFO-O-demethylase in different strains of Bactrocera dorsalis

2.2.3 桔小實(shí)蠅不同品系的谷胱甘肽-S 轉(zhuǎn)移酶(GST)活性

各地區(qū)桔小實(shí)蠅成蟲的GST 活性測(cè)定結(jié)果表明廣東茂名種群的GST 活性最高，是相對(duì)敏感品系的2.2557 倍;江蘇無(wú)錫和廣東澄海種群的GST活性次之，分別為相對(duì)敏感品系的2.0283 和2.0102 倍;而廣東廣州種群活性只有相對(duì)敏感品系的1.1622 倍，最低;其它各地區(qū)桔小實(shí)蠅品系的GST 活性與相對(duì)敏感品系的比值在1.2145 至1.9030 之間(表4)。

2.3 桔小實(shí)蠅地理品系幾種酶活性和抗性水平相關(guān)性分析

表5 中相關(guān)性分析結(jié)果顯示，桔小實(shí)蠅體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性和對(duì)敵百蟲抗性水平相關(guān)系數(shù)為0.41，達(dá)顯著性水平;羧酸酯酶活性與桔小實(shí)蠅對(duì)高效氯氰菊酯抗性水平存在極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.50。桔小實(shí)蠅對(duì)敵百蟲和阿維菌素的抗性水平之間也存在極顯著關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為0.76。研究結(jié)果顯示了桔小實(shí)蠅幾種解毒酶與抗藥性水平之間以及對(duì)不同的殺蟲劑的抗性水平之間存在顯著聯(lián)系，表明了桔小實(shí)蠅解毒酶活性對(duì)殺蟲劑的響應(yīng)作用是復(fù)雜的，不同解毒酶活性對(duì)不同殺蟲劑的抗性水平相關(guān)性程度不同。

表3 桔小實(shí)蠅地理種群的羧酸酯酶活性Table 3 The CarE activity in different strains of Bactrocera dorsalis

表4 桔小實(shí)蠅地理種群的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性Table 4 The GST activity in different strains of Bactrocera dorsalis

表5 幾種酶活性比值與各抗藥性水平的相關(guān)性分析Table 5 The correlative analysis of detoxification enzyme activity ratios and resistance levels

(續(xù)上表)

2.4 各幾種酶活性與殺蟲劑抗性水平的通徑分析

通徑分析分析結(jié)果見表6 和圖1。圖1 中，除對(duì)角線所示的直接通徑系數(shù)外的數(shù)值均為間接通徑系數(shù)，它表明某一酶活對(duì)抗性水平的評(píng)分的影響力是通過對(duì)其他酶的活性影響而間接影響其抗性水平。其結(jié)果表明，GST 活性對(duì)敵百蟲的抗藥性水平的直接通徑系數(shù)分別為0.4414，起到正向作用;而MFO-O-脫甲基活性和CarE 活性對(duì)敵百蟲的抗性水平的直接通徑系數(shù)分別為-0.1768和-0.3531，對(duì)抗性水平的均起到負(fù)向作用。MFO-O-脫甲基活性、CarE 活性和GST 活性對(duì)高效氯氰菊酯抗性水平的直接通徑系數(shù)為0.3311，0.4946 和0.1775，均起到正向作用。三種解毒酶中，只有GST 活性與阿維菌素的抗性水平的直接通徑系數(shù)很小，為0.0668;其余2種酶，MFO-O-脫甲基活性和CarE 活性對(duì)阿維菌素的直接通徑系數(shù)均為負(fù)值，分別為-0.0608 和-0.1913，對(duì)阿維菌素抗性程度起到負(fù)向作用。

表6 解毒酶活性比值和不同抗藥性指標(biāo)的通徑分析Table 6 Path coefficient analysis of each detoxification enzymes activity on resistance level traits

圖1 解毒酶活性與抗藥性水平的評(píng)分通徑圖Fig.1 The path analysis of detoxification enzymes activity on resistance level

3 結(jié)論與討論

對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性是害蟲的自然適應(yīng)性特征，是害蟲不斷的應(yīng)對(duì)殺蟲劑而形成的防御性策略?？剐援a(chǎn)生的代謝特征主要是解毒作用的增強(qiáng)，生理水平上顯然有多種酶系參與，將進(jìn)入蟲體內(nèi)的藥劑經(jīng)過氧化、還原、水解或結(jié)合后，降低其毒性，或增強(qiáng)其水溶性，將其排出體外，達(dá)到解毒目的。而各種酶在不同類型的抗藥性發(fā)展過程中的作用是不同的，本研究的結(jié)果表明，桔小實(shí)蠅體內(nèi)解毒酶系的活性變化與抗性水平不存在單一增長(zhǎng)關(guān)系，而是各種酶在蟲體內(nèi)維持一個(gè)活性優(yōu)化的平衡狀態(tài)，對(duì)不同類型的殺蟲劑多種解毒酶的代謝維持著一種均衡，即獲得代謝解毒能力并保持其它代謝正常有序，來達(dá)到代謝殺蟲劑的目的。蟲體的抗藥代謝過程是相當(dāng)復(fù)雜的，有多種解毒酶、水解酶、合成酶和靶標(biāo)酶以及特異蛋白質(zhì)的參與(Araújo et al.，2008;Huang et al.，2004;Oppenoorth，1965)。本文只選用了3種報(bào)道較多的解毒酶，其通徑分析結(jié)果也只是顯示出在3種酶活性相互影響下的抗性水平關(guān)系，如MFO-O-脫甲基活性和CarE 活性對(duì)敵百蟲的抗藥性水平起負(fù)相關(guān)的結(jié)果，即表明MFO-O-脫甲基活性和CarE 活性是相對(duì)于GST 活性的比較下所呈現(xiàn)負(fù)向作用，并不是說明MFO-O-脫甲基活性和CarE活性對(duì)敵百蟲代謝變化中表現(xiàn)負(fù)向關(guān)系。

昆蟲的抗性分子遺傳和進(jìn)化的關(guān)鍵就是點(diǎn)突變和調(diào)節(jié)突變，而代謝抗性很可能是調(diào)節(jié)突變，引起昆蟲個(gè)體水平對(duì)殺蟲劑適應(yīng)性進(jìn)化的主要原因是抗性相關(guān)酶量或活性的變化 (劉澤文等，2002)。當(dāng)前，昆蟲抗藥性的生理學(xué)和分子生物學(xué)研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但害蟲抗藥性發(fā)展規(guī)律和趨勢(shì)預(yù)測(cè)應(yīng)與此相對(duì)應(yīng)的生理生化等指標(biāo)相結(jié)合，才能深入了解這幾種解毒酶的活性與抗性水平的關(guān)系，為克服和延緩桔小實(shí)蠅的田間抗性水平提供重要的科學(xué)理論依據(jù)。

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