沙偉橋 許朋＊ 羅海燕

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū),廣東珠海 519041:2.大連工業(yè)大學(xué),遼寧大連 116034)

貴州桐梓天花粉rDNA ITS序列分析

沙偉橋1許朋1＊羅海燕2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū),廣東珠海 519041:2.大連工業(yè)大學(xué),遼寧大連 116034)

目的:對(duì)貴州桐梓天花粉rDNA ITS序列(包括ITS1、5.8S和ITS2)進(jìn)行序列測(cè)定與分析,為其基源鑒定和品質(zhì)評(píng)價(jià)提供分子依據(jù)。方法:采取改良CTAB法提取天花粉總DNA,PCR擴(kuò)增ITS序列后直接測(cè)序,在GeneBank中將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源搜索,再將同源序列用MEGA5.1軟件進(jìn)行變異位點(diǎn)分析、遺傳距離測(cè)定及同屬植物ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。結(jié)果:貴州桐梓天花粉ITS序列與GeneBank中三組同源序列存在變異位點(diǎn)107個(gè)、遺傳距離范圍在0.0252到0.0597之間、物種間親緣存在較明顯的遠(yuǎn)近關(guān)系。結(jié)論:ITS序列可以有效地鑒別貴州桐梓天花粉,ITS序列分析技術(shù)對(duì)近緣種類群間系統(tǒng)學(xué)研究及品種鑒定具有較大的意義,同時(shí)為進(jìn)一步利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定中藥材奠定了基礎(chǔ)。

天花粉 rDNA ITS序列 藥材

天花粉來(lái)源為葫蘆科植物栝樓或雙邊栝樓的干燥根,亦稱瓜蔞根、栝樓根。栝樓為多年生草質(zhì)藤本,又名瓜蔞、大圓瓜、鳥瓜、吊瓜。栝樓喜溫暖潮濕氣候,較耐寒,不耐干旱,生于山坡、草叢、林緣半陰處。栝樓以家種為主,主產(chǎn)于貴州桐梓、河南安陽(yáng)、山東濟(jì)南、湖北荊州等地[1]。栝樓屬Trichosanthes L.植物全世界有84種8變種,中國(guó)有37種6變種,本屬有多種藥用植物,藥典2005年版收載了2種,《中藥志》收載了7種,例如栝樓T.kirilowii Maxim,其果實(shí)(瓜萎)、根(天花粉)都是常用中藥。從栝樓根中提取的天花粉蛋白(trichosanthin)是中期妊娠引產(chǎn)的有效蛋白質(zhì),同時(shí)其亦具有抗葡萄胎活性及抗艾滋病(AIDS)的活性。調(diào)查發(fā)現(xiàn)各地所用天花粉來(lái)源復(fù)雜,不同植物來(lái)源的天花粉,其療效也不完全一致,某些混淆品如湖北括樓、木鰲子根等還有一定的不良反應(yīng)[2,3]。準(zhǔn)確鑒別植物基源是正確開發(fā)利用和用藥安全有效的基礎(chǔ),已有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分子技術(shù)以及蛋白測(cè)植物的核糖體DNA(ribosomal DNA,rDNA)是由串聯(lián)重復(fù)排列的單位組成,每個(gè)單位基因組等方法對(duì)天花粉及其混淆品進(jìn)行鑒別的探索[4,5]。序列從5’到3’依次為:外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ETS)、18S rDNA、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internal transcribed spacer,ITS1)、5.8S rDNA、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)、28S rDNA和基因間隔序列(IGS)。其中ITS序列是中度保守區(qū),進(jìn)化速率較快,既具有核苷酸序列高度變異性又有長(zhǎng)度上的保守性,說(shuō)明這些間隔區(qū)的序列很容易在近緣類群間排序,而且豐富的變異可在較低的分類階元上(如屬間、種間)解決植物系統(tǒng)發(fā)育問題,因此被廣泛用于近緣屬間、屬內(nèi)以及種內(nèi)居群間的差異性研究[5-7]。ITS1、ITS2分別位于18S～5.8SrDNA、5.8S～26S rDNA之間,而18SrDNA、5.8SrDNA、26SrDNA的序列又非常保守,這樣就可以用與它們序列互補(bǔ)的通用引物對(duì)ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序。但是ITS1、ITS2序列的核苷酸序列變化較大,可以提供豐富的系統(tǒng)學(xué)信息[8,9]。近年來(lái),rDNAITS序列應(yīng)用于中藥材的鑒別也有較多報(bào)道[7],關(guān)于天花粉的研究,前人主要集中于對(duì)同屬間物種的顯微和理化鑒定,而根據(jù)rDNAITS序列鑒別天花粉則尚未見報(bào)道[10-12]。本文擬對(duì)天花粉的rDNAITS序列進(jìn)行PCR、測(cè)序和序列分析,并建立天花粉rDNA ITS數(shù)據(jù)庫(kù)。

圖1 ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

表1 天花粉序列對(duì)比

表2 遺傳距離分析

圖2 NJ樹物種鑒定

天花粉實(shí)驗(yàn)材料樣品于2011年12月采自于貴州桐梓,樣品號(hào):KT030301,登錄號(hào):KC733407,所用標(biāo)本由牛憲立老師提供。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

(1)70%乙醇:量取70ml的無(wú)水乙醇,30ml雙蒸水,混勻。(2)0.5mol/LEDTA(pH=8.0):稱取EDTA-2Na-2H2O18.7g,加入雙蒸水75ml,用NaOH調(diào)pH至8.0,加雙蒸水定容至100ml。(3)0.5mol/LTris-HCl(pH=8.0):稱取Tris 30.28g,加入雙蒸水350ml,用HCl調(diào)pH至8.0,再加雙蒸水定容至500ml。(4)3mol/L NaAc溶液:稱取無(wú)水乙酸鈉24.608g,先加入雙蒸水80ml加熱溶解,再加雙蒸水定容至100ml,121℃滅菌15min,4℃保存。(5)CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液:稱取CTAB10g,加70ml雙蒸水溶解,再取0.5mol/LTris-HCl(pH:8.0)40ml,0.5mol/LEDTA(pH:8.0)8ml,5mol/LNaCl56ml,加雙蒸水定容至200ml,室溫保存,使用前先加入0.2%β-巰基乙醇。(6)氯仿:異戊醇(24:1):量取192ml氯仿,8ml異戊醇,混勻。(7)TE液:量取0.5mol/L Tris-HCl(pH:8.0)4ml,0.5mol/L(pH:8.0)EDTA(乙二胺四乙酸)0.4ml,加雙蒸水定容至200ml,分裝至3個(gè)干凈小瓶中,121℃滅菌15min,4℃保存。(8)5xTBE溶液:稱取Tris(三羥甲基氨基甲烷)16.2g,硼酸8.25g,0.5mol/L EDTA(pH:8.0)6ml,加雙蒸水至300ml,室溫下保存,臨用時(shí)稀釋10倍。(9)苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1):分別量取苯酚、氯仿:異戊醇(24:1)各100ml,再混勻。(10)隨機(jī)引物、TaqDNA聚合酶、β-巰基乙醇、dNTP、MgCL2。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

HH-W21.C600電熱恒溫水溫箱(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠):10R型冷凍高速離心機(jī)(Eppendorf):FH-202B紫外透射分析儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司):ema-8000型PCR儀(珠海黑馬儀器廠):島津UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)DYC型電泳儀(北京六一儀廠)。

1.2 方法與步驟

1.2.1 DNA提取(改良CTAB法)

(1)稱取天花粉200mg,剪成小碎片放置于冷研缽中,用液氮迅速研成糊狀或粉狀,將糊狀或粉狀物轉(zhuǎn)入至預(yù)冷的1.5ml干凈離心管中,加入600l預(yù)熱的DNA提取緩沖液,充分搖勻,65℃水浴1h,在水浴過程中每10min溫和顛倒混勻1次。(2)取出離心管,使之恢復(fù)室溫,加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)抽提,輕緩顛倒混勻,室溫下12000rpm離心10min。(3)取上清轉(zhuǎn)移至另一新的1.5ml離心管中,加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)輕輕顛倒混勻后9000rpm離心15min。(4)吸取上清液,加入1/10體積的10%CTAB溶液(10%CTAB,0.7mol/L NaCl),再加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)重復(fù)抽提1次,重復(fù)氯仿-異戊醇抽提,輕緩顛倒混勻,室溫下12000rpm離心10min。(5)上清加入2/3倍體積異丙醇,輕輕顛倒混勻,-20℃靜置30min后,4000rpm,離心10min,棄去上清液。用70%乙醇和無(wú)水乙醇洗滌沉淀各洗1次,室溫吹干后溶于200μl TE。(6)當(dāng)沉淀無(wú)乙醇味時(shí),將DNA溶于300lTE,加入5lRNA酶,37℃恒溫水浴箱保溫1h。(7)上清液移入新的離心管中,加入1/10體積的3mol/LNaCl(pH=5.2)溶液,混勻后加入2倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇,顛倒混勻,-20℃放置50min,DNA形成絮狀沉淀。8)鉤出DNA絮團(tuán),在70%乙醇中漂洗,分別加入70%和90%乙醇去除殘留的無(wú)機(jī)離子,在室溫下自然風(fēng)干直至沉淀無(wú)乙醇味,視沉淀的多少而溶入適量的TE緩沖液,分裝后放入－20℃儲(chǔ)存或放入4℃待用。

1.2.2 DNA純度及片段大小的檢測(cè)

(1)純度檢測(cè):將DNA樣品稀釋200倍后,在UV-2550紫外分光光度計(jì)上測(cè)定其在260nm、280nm處吸光度值,根據(jù)OD260、OD260/OD280值來(lái)判斷DNA的濃度和純度。[附:DNA濃度計(jì)算公式:DNA濃度(ug/ml)=OD260×稀釋倍數(shù)×50]。(2)電泳檢測(cè):運(yùn)用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,檢測(cè)樣品DNA片段的大小,觀察并且拍照。

1.2.3 電泳-瓊脂糖凝膠板配制方法

(1)制備1.0%的瓊脂糖凝膠(50ml):稱取0.5g瓊脂糖于干凈錐形瓶中,再加入50ml的0.5×TBE。酒精燈加熱煮沸至瓊脂糖全部融化,即得1.0%瓊脂糖凝膠液。(2)取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽洗干凈并晾干,取膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好,形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子。(3)將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液中加入0.5L的核酸染色劑Goldview,輕輕混勻。小心地倒入有機(jī)玻璃板上,使膠液緩慢展開,直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。(4)室溫下靜置直至凝膠完全凝固,垂直輕拔梳子,取下膠帶,將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加0.5×TBE電泳緩沖液至沒過膠板為止。(5)取1L上樣緩沖液與DNA樣品混合。用10l微量移液器分別將Marker和樣品加入膠板的樣品槽內(nèi),每加完一個(gè)樣品,應(yīng)更換一個(gè)加樣頭,以防污染,加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。(6)加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳,正確連接電泳槽和電源,黑線連陰極,紅線連陽(yáng)極,電壓80V,樣品由負(fù)極(黑色)向正極(紅色)方向移動(dòng),當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處時(shí),停止電泳。(7)在紫外燈下觀察,DNA存在則顯示出紅色熒光條帶,采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4 ITS擴(kuò)增和測(cè)序

(1)參考white等設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物,用于擴(kuò)增ITS1、5.8S、ITS2完整序列,P1(5’-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3’)位于18S上,P2(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)位于26S上,由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。(2)采用P1和P2雙引物整段擴(kuò)增,在50L反應(yīng)體系中,內(nèi)含基因組DNA(1μL)、引物各(1L)、DNA聚合酶2.5U、dNTP(0.1mmol/L)、MgCl2(1.5mmol/L)。反應(yīng)條件:PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min,94℃變性2min,52℃退火3min:72℃延伸2min,循環(huán)30次,72℃延伸10min。(3)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定后,分別送上海生工和上海英駿廣州分公司做雙向測(cè)序。

1.2.5 序列分析

經(jīng)公司測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行手工校正,采用MEGA5.1軟件對(duì)4組rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析,遺傳距離測(cè)定,并用MEGA5.1軟件繪制NJ(最大似然法)系統(tǒng)樹。

2 結(jié)果

2.1 DNA的濃度

200mg貴州桐梓天花粉樣品經(jīng)改良CTAB法提取DNA后,采用紫外分光光度計(jì)測(cè)得總DNA量為520μg/ml,OD260/OD280值為1.822。

2.2 PCR擴(kuò)增

天花粉樣品經(jīng)改良CTAB法提取總DNA,PCR擴(kuò)增所用Maker大小分別為100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp,擴(kuò)增后得到了產(chǎn)物(見圖1),條帶清晰、無(wú)非特異條帶、無(wú)拖尾現(xiàn)象,表明擴(kuò)增結(jié)果很好,可用于測(cè)序。提取的貴州天花粉總DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增之后得rDNA片段大小為2000bp,rDNA ITS序列的長(zhǎng)度都在500bp到750bp之間。

M:DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物(DL2000):1為樣品ITS:2為樣品總rDNA

2.3 測(cè)序結(jié)果及序列分析

經(jīng)測(cè)序得到貴州桐梓天花粉rDNA ITS序列,根據(jù)近源種天花粉基因庫(kù)中已確定的5.8S、28S序列與標(biāo)本序列進(jìn)行對(duì)比分析,確定rDNA ITS1和ITS2與18S、5.8S、26S的界限,并建立標(biāo)本登錄號(hào)為KC733407。由Blast軟件搜索天花粉標(biāo)本rDNA ITS序列同源的三組序列,登錄號(hào)分別為FJ980304、GU059533、HE661360。四組序列序號(hào)分別為下圖表中(1)、(2)、(3)、(4),經(jīng)MEGA5.1軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析后結(jié)果是ITS區(qū)序列存在107個(gè)變異位點(diǎn),占總位點(diǎn)15.1%,具體變異位點(diǎn)見表1:遺傳距離在0.0252到0.0597之間(表2):由MEGA5.1軟件構(gòu)建鄰接樹所得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)中,標(biāo)本天花粉與GeneBank中登錄號(hào)為GU059533物種聚在一起,表明二者有較近的親緣關(guān)系,而與其他兩種同源物種親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

結(jié)合表1、表2、圖2可判斷出貴州桐梓天花粉的rDNA ITS區(qū)序列與GeneBank中已確立同屬物種的ITS序列有一定程度的差異,即貴州桐梓天花粉rDNA ITS序列具有特異性,這種特異性為貴州桐梓天花粉的基源鑒別提供了分子基礎(chǔ)。

3 討論

人們?cè)趯?duì)植物的不斷探索與開發(fā)利用的過程中發(fā)現(xiàn)了藥用植物即中藥,中藥對(duì)于疾病的預(yù)防治療起著非常重要的作用,雖然人類對(duì)中藥的使用已有上千年的歷史,但由于大多數(shù)藥用植物一般都來(lái)源廣泛,且不同來(lái)源的同種藥用植物其療效也存在一定的差異,甚至藥效完全相反,因此,建立完善的藥用植物鑒別體系是人類安全用藥的前提和基礎(chǔ)。隨著遺傳學(xué)知識(shí)的不斷挖掘和豐富以及植物大部分次生代謝產(chǎn)物分離方法的完善與結(jié)果鑒定技術(shù)的改進(jìn),進(jìn)一步強(qiáng)化了人們對(duì)藥用植物的正確認(rèn)識(shí)和研究:近代分子學(xué)方面的不斷突破,使以形態(tài)組織學(xué)、解剖學(xué)等客觀指標(biāo)為劃分依據(jù)的傳統(tǒng)分類學(xué)得到了補(bǔ)充,為藥用植物系統(tǒng)與進(jìn)化研究提供了可靠豐富的資料,為解決分類學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育、物種形成與進(jìn)化等方面提供了極為有力的技術(shù)途徑。目前,許多研究者將DNAITS區(qū)的特異性應(yīng)用于藥用植物的鑒別,為探索藥用植物的遺傳差異和鑒定中藥材品種的基源問題提供了新的技術(shù)和方法。

DNAITS區(qū)序列具有多種優(yōu)點(diǎn),例如:進(jìn)化速率快讓不同來(lái)源的同種藥用植物具備遺傳特異性:基因片段短、直觀性強(qiáng)、重現(xiàn)性好都使得PCR擴(kuò)增和測(cè)序簡(jiǎn)便高效。本實(shí)驗(yàn)中為了得到準(zhǔn)確的ITS序列信息,采用了高保真DNA聚合酶,不同批次的PCR產(chǎn)物分別送交兩個(gè)公司(上海生工和廣州英駿)進(jìn)行雙向測(cè)序,測(cè)序結(jié)果基本一致。

獲取高質(zhì)量的DNA是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)在基因組DNA的提取中,加入液氮研磨,使植物細(xì)胞壁破裂。CTAB提取液中的CTAB為十六烷基三甲基溴化銨,是一種陽(yáng)離子去污劑,可溶解細(xì)胞膜,它能與核酸形成復(fù)合物,在高鹽溶液中是可溶的,當(dāng)降低溶液鹽的濃度到一定程度時(shí)從溶液中沉淀,通過離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白、多糖類物質(zhì)分開,然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中,再加入NaAc和乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇中:Tris-HCl(pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境,防止核酸被破壞:EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性防止DNA降解:NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境:β-巰基乙醇是抗氧化劑,能有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除基因組DNA。因?yàn)榉幽苁沟鞍鬃冃?蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。酚的變性抽提作用要比氯仿好,但酚和水有一定比例的互溶:氯仿有強(qiáng)烈的脂溶性,去除脂類雜質(zhì),但其和水基本上沒有互溶,而酚又溶于氯仿中,所以綜合二者的效果,先用酚抽,再用氯仿抽,既能保證蛋白的抽提效果,又能去除核酸溶液中的少量酚。而異戊醇不僅能減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡,降低表面張力,從而減少氣泡產(chǎn)生。而且,異戊醇有助于分相,使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。在沉淀DNA時(shí),通常要在溶液中加入單價(jià)的陽(yáng)離子,如NaCl或NaAc,Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷,減少DNA分子之間的同性電荷相斥力,而易于聚集沉淀,加入乙醇可以除去鹽離子。加入RNase降解RNA,從而得到純凈的DNA分子。

通過對(duì)不同產(chǎn)區(qū)天花粉序列的比對(duì)分析、遺傳距離的測(cè)定、物種親緣鑒定,發(fā)現(xiàn)天花粉的來(lái)源不同其基因序列也有所差異,特別是rDNA ITS區(qū)序列存在明顯的差異,這為本研究的可行性提供了確切的依據(jù)。在對(duì)實(shí)驗(yàn)方法的探索中,我們預(yù)先采用RAPD技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)區(qū)的天花粉進(jìn)行鑒定,但結(jié)果顯示不同產(chǎn)區(qū)的天花粉均擴(kuò)增出相同的條帶,無(wú)法實(shí)現(xiàn)本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?這很大程度是由于RAPD技術(shù)本身存在重復(fù)性差且易受藥材產(chǎn)地和儲(chǔ)存時(shí)間影響的局限性,故利用RAPD技術(shù)來(lái)分類和鑒定藥用植物的依據(jù)不完全可靠確切,而采用rDNA ITS區(qū)序列分析技術(shù)可完全避免RAPD技術(shù)的不足,本研究就完全證明ITS序列分析能夠正確鑒定天花粉的基源。

4 結(jié)語(yǔ)

ITS序列可以有效地鑒別貴州桐梓天花粉,ITS序列分析技術(shù)對(duì)近緣種類群間系統(tǒng)學(xué)研究及品種鑒定具有較大的意義,同時(shí)為進(jìn)一步利用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定中藥材奠定了基礎(chǔ)。

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沙偉橋(1992—),男,遵義醫(yī)學(xué)院生物工程專業(yè)本科生,研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

?通訊作者:許朋(1993—),男,遵義醫(yī)學(xué)院生物工程專業(yè)本科生,研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué),已主持院級(jí)科研課題兩項(xiàng),參加省級(jí)課題一項(xiàng),發(fā)表論文多篇。