王前 佟乃興 劉燁華（大連華信理化檢測中心有限公司）

生活飲用水及其水源水等水體受到生活污水、工農(nóng)業(yè)廢水或人和動物糞便的污染后，水中的細菌數(shù)量可大量增加，其中病原菌也隨之增加，引發(fā)傳染，危害人類健康，因而水中細菌總數(shù)和大腸菌數(shù)量可反映水體受微生物污染的程度。水中細菌總數(shù)往往同水體受有機物污染的程度呈正相關(guān)。故水的細菌學檢驗對了解水體被污染的程度，在流行病學和提供水質(zhì)標準中具有重要意義和價值，它是評價水質(zhì)污染程度的重要指標之一。

我們采用平板計數(shù)法，檢驗水中的細菌總數(shù)，細菌總數(shù)是指1mL水樣在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃經(jīng)24h培養(yǎng)后，所生長的細菌菌落的總數(shù)（CFU）。在實驗過程中根據(jù)相關(guān)規(guī)定，每次實驗必須由同一實驗人員，進行平行樣測定，因此，我們采用同一陽性水樣，做15份平行樣，對水質(zhì)中細菌總數(shù)進行平行樣評定。但這個過程中一定會存在無法避免的誤差，即不確定度，本實驗在此對水質(zhì)中細菌總數(shù)檢驗中不確定度進行評定。

一、實驗材料與依據(jù)

1.1 測試樣品：

以正規(guī)采樣方法采集的，已確定為陽性的水樣。

1.2 實驗材料

培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）

稀釋水：超純水裝置制備的純化水，經(jīng)121℃，高壓滅菌15min，冷卻至室溫

定量移液管、90cm培養(yǎng)皿、250ml錐形瓶

1.3 實驗設(shè)備

超凈工作臺 型號：BCN-1360B，生產(chǎn)廠家：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司

恒溫培養(yǎng)箱 型號：HPP-9272，生產(chǎn)廠家：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司

鼓風干燥箱 型號：HPG-9245，生產(chǎn)廠家：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司

高壓滅菌鍋 型號：ES315，生產(chǎn)廠家：日本Tomy

超純水裝置 型號：611UF，生產(chǎn)廠家：賽多利斯

1.4 實驗依據(jù)

《水和廢水監(jiān)測分析方法》第四版，細菌總數(shù)的測定B（P694），

二、實驗方法：

2.1 實驗準備

2.2.1 實驗前，先將實驗用器具用高壓滅菌鍋以121℃，20min滅菌，并用鼓風干燥箱烘干；

2.2.2 超凈工作臺無菌操作區(qū)域臺面，用75%酒精擦拭；實驗前紫外照射20mins，開啟風機10mins，進行實驗操作過程中保持風機開啟；

2.2.3 確認實驗用儀器設(shè)備在檢定周期范圍內(nèi)，同時可以正常使用；

2.2.4 確認水樣為陽性，同時并確認菌落范圍，原水樣菌落數(shù)超出300，稀釋10倍后菌落數(shù)在30～300之間；

2.2.5 以無菌操作，準備15份水樣。

2.2 實驗操作

2.2.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基滅菌后，自然冷卻，在溫度在50℃左右時，進行實驗；

2.2.2 以無菌操作的方式，取1ml水樣置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，倒入15～20ml，45℃左右的營養(yǎng)瓊培養(yǎng)基，立即旋搖（不能將培養(yǎng)基搖到平皿外）充分混勻；一份樣品要做平行樣對照；

2.2.3 待營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，底面朝上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

2.2.4 培養(yǎng)24小時后，去除平皿，進行菌落計數(shù)。

2.3 數(shù)據(jù)模型

細菌總數(shù)=A××fn

式中：A培養(yǎng)后細菌總數(shù) cfu/ml；

fn為樣品的稀釋倍數(shù)；

三、結(jié)果與討論

3.1 稀釋倍數(shù)不確定度分量：

根據(jù)方法要求，取1ml水樣加入到9ml無菌水中，以稀釋樣逐級稀釋；此間使用定量移液管，根據(jù)校準證書，查看10ml、1ml分度吸管誤差可計算標準不確定度分別為u1=±0.05、u2=±0.007；

3.2 菌落數(shù)計數(shù)不確定度

根據(jù)檢測方法的要求，培養(yǎng)15份稀釋樣品平行測定陽性水樣結(jié)果，進行對數(shù)分析：

序號Log值2.031 2.151 2.116 2.100 2.125 2.099 2.111 2.114 2.083 2.035 2.079 2.157 2.130 2.097 2.104 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0平皿1 105 135 125 134 127 125 125 126 117 114 131 134 119 110 136 Log值2.019 2.130 2.097 2.125 2.102 2.097 2.095 2.100 2.068 2.057 2.116 2.125 2.076 2.041 2.132平皿2 108 142 131 126 134 126 129 130 121 109 120 144 135 125 127 11 12 13 14 15 S2 0.00007555 0.00020854 0.00017485 0.00031527 0.00027356 0.00000150 0.00011889 0.00009211 0.00010657 0.00023059 0.00066355 0.00049206 0.00150080 0.00154109 0.00039581

所有菌落數(shù)的平均值，A平均=125 cfu/ml。

3.3 合成相對不確定度

3.4 不確定度評定結(jié)果

按照方法進行分析測定，擴展不確定度中，取擴展因子K=2，U(C)=10×2=20，即利用平板計數(shù)法檢驗水中細菌總數(shù)，不確定度評定結(jié)果為細菌總數(shù)=125±20 cfu/ml。

[1]國家環(huán)境保護總局，水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）[M]，細菌總數(shù)的測定（P694），2002：694-697.

[2]JJF 1059-2012，測量不確定度評定與表示[S].