王艷秋，洪 勇，岳霄霄，林華峰

(安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院合肥 230036)

煙粉虱Bemisia tabaci 是一種世界性害蟲，可危害煙草、蔬菜等多種作物(張芝利等，2001;王茂明等，2006)，其平均每年在全球造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)億美元(Ittrich et al.，1994;王聯(lián)德等，2003)。由于煙粉虱的嚴重發(fā)生，依賴廣譜性農(nóng)藥的大量使用，導致煙粉虱產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，而且還存在殺傷天敵、污染環(huán)境等副作用(Horowitza et al.，1996;王秀芳等，2010)。褐飛虱Nilaparvata lugens 是我國水稻的主要害蟲之一，它不僅直接危害水稻，還傳播植物病毒病，給我國的水稻生產(chǎn)量造成嚴重損失(張松影等，2011;李茂業(yè)等，2012;林華峰等，2013)。目前，煙粉虱和褐飛虱的防治主要依靠化學防治，但由于化學農(nóng)藥的長期大面積不合理使用，導致煙粉虱和褐飛虱的抗藥性呈不同程度的增強，再加上高效新型農(nóng)藥更新速度慢，使得煙粉虱和褐飛虱的發(fā)生和危害越來越猖獗嚴重(廖世純等，2008;Teng et al.，2010;Pan et al.，2011;盛仙俏等，2013)。

隨著環(huán)保意識的增強和對無公害農(nóng)產(chǎn)品需求的不斷提高，人們已經(jīng)開展尋找開發(fā)新型生物農(nóng)藥資源(劉旭等，2007)，因此具有選擇性高、不易使害蟲產(chǎn)生抗藥性、特異性強、簡便安全、防治效果好及開發(fā)利用途徑廣等優(yōu)點的生物農(nóng)藥引起了較多學者和科研人員的關(guān)注(賀偉華等，2007)。近些年來，以白僵菌、綠僵菌為代表的真菌殺蟲藥劑在害蟲的持續(xù)控制及維護生物多樣性方面所發(fā)揮的作用正越來越受到人們的關(guān)注。如白僵菌用于防治稻飛虱、煙粉虱等多種農(nóng)業(yè)及經(jīng)濟作物害蟲(陳德蘭等，2013);綠僵菌對褐飛虱、瓢蟲、菜青蟲和蝗蟲等害蟲均有較為顯著的防治效果(董輝等，2005;劉樹峰等，2007;郭艷瓊等，2007;Li et al.，2012);李茂業(yè)等(2011)從罹病褐飛虱蟲體上分離出一株黃綠綠僵菌，對褐飛虱的致病率達83.8%。為此，本實驗旨在從罹病二化螟幼蟲體上分離真菌菌株，經(jīng)分離鑒定，選擇培養(yǎng)性狀較好的供試菌株，對煙粉虱和褐飛虱兩種重要農(nóng)業(yè)害蟲進行室內(nèi)毒力測定，篩選出毒力較強的菌株，以期為殺蟲真菌防治煙粉虱和褐飛虱提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株:從浙江省杭州市等地區(qū)采集自然感病致死的昆蟲，挑取感染真菌致死的二化螟幼蟲500 份，經(jīng)安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院昆蟲研究室分離純化得到菌株Bb32、Bbr14、M23、Nr27 和A26，培養(yǎng)并保存。

煙粉虱蟲源:采自安徽省和縣溫室蔬菜大棚，在安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院人工氣候室室內(nèi)用黃瓜連續(xù)飼養(yǎng)10 代以上。

褐飛虱蟲源:采自安徽省廬江縣農(nóng)戶未打藥的水稻田，在安徽農(nóng)業(yè)大學植保學院智能人工氣候培養(yǎng)室內(nèi)繁殖10 代以上。

PDA 培養(yǎng)基:土豆(去皮)200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20-25 g、蒸餾水1 L，pH 自然。

SDAY 培養(yǎng)基:葡萄糖4 g，瓊脂2 g，蛋白胨1 g，酵母浸出粉1 g，蒸餾水100 mL，pH 自然。

1.2 試驗方法

1.2.1 真菌生物學鑒定

篩選5種真菌分別接種于PDA 與SDAY 培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。記錄在培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d 后菌落顏色變化、直徑大小、產(chǎn)孢初始時間、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)率，并觀察菌株分生孢子大小及形狀、孢子梗的特點以及產(chǎn)孢細胞的著生方式和形態(tài)特征等。

1.2.2 生長速率與孢子萌發(fā)率測定

采用點植培養(yǎng)法接種。配制濃度為1.0×108孢子/mL 的孢懸液，點植于滅菌冷卻的SDAY 培養(yǎng)基及PDA 培養(yǎng)基平板上，每皿1 點，重復3 次，置于(25±1)℃、RH＞85%、12L∶12D 光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第3 天起，以十字交叉法測量菌落生長直徑，取均值，比較各菌株在PDA 和SDAY 培養(yǎng)基上的生長速率，并測定不同培養(yǎng)基上菌株的孢子萌發(fā)率。

1.2.3 真菌對煙粉虱和褐飛虱的毒力測定

將5 株菌株接種在SDAY 培養(yǎng)基上，于(25±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10 d，將分生孢子粉刮到盛有20 mL 0.05%吐溫-80 潤濕劑的試管中，充分震蕩混勻，血球計數(shù)板檢測，均配制成濃度為1.0×108孢子/mL 的懸浮液。

采用葉片浸液法，對煙粉虱成蟲及若蟲進行室內(nèi)毒力測定。挑取煙粉虱成蟲及若蟲，移入盛有處理葉片的燒杯中飼養(yǎng)，置于相對溫度(26±1)℃、相對濕度60%-80%、光照周期14L∶10D的人工氣候室中，分別處理60 頭成蟲及若蟲，共計5個處理，重復3 次，并以含0.05%吐溫-80 的純凈水作對照，每天觀察并記錄死亡數(shù)和僵蟲數(shù)，連續(xù)觀察10 d。

利用塔式噴霧法，進行褐飛虱成蟲及若蟲的室內(nèi)毒力測定，培養(yǎng)皿用單層紗布封口，處理設置同煙粉虱，每個處理噴霧量為10 mL。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

依據(jù)Abbott 公式計算校正死亡率。

實驗數(shù)據(jù)使用DPS 統(tǒng)計分析軟件(Tang and Zhang，2013)進行方差分析，并采用最小顯著差異法(LSD)進行多重比較及生物統(tǒng)計模型進行分析。以時間(d)為X，累積校正死亡率的幾率值為Y，采用幾率值分析法，計算毒力回歸方程和致死中時間(LT50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基上5種真菌菌落特征

比較所篩選的真菌菌株Bb32、Bbr14、M23、Nr27、A26 在兩種培養(yǎng)基上的菌落顏色、形態(tài)特征及基質(zhì)色澤等，初步鑒定結(jié)果顯示5 株菌株分別為布氏白僵菌、球孢白僵菌、綠僵菌、萊氏野村菌和曲霉。由表1 看出，兩株白僵菌在兩種培養(yǎng)基上的菌落培養(yǎng)性狀相差不大，而綠僵菌、萊氏野村菌、曲霉在兩種培養(yǎng)基上的菌落培養(yǎng)性狀相差甚多。

表1 供試菌株在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征比較Table 1 Morphological characteristics tested strains on different media

2.2 不同培養(yǎng)基上5種真菌培養(yǎng)指標

2.2.1 直徑及初始產(chǎn)孢時間

不同真菌在PDA 和SDAY 培養(yǎng)基的菌落生長直徑和產(chǎn)孢時間如表2 和3 所示，相同菌株在SDAY 培養(yǎng)基上的生長速率快于PDA 培養(yǎng)基，而相同菌株在PDA 培養(yǎng)基上的初始產(chǎn)孢時間短于SDAY 培養(yǎng)基。曲霉A26 在3-11 d 中菌落直徑與菌株Bb32、Bbr14、M23 和Nr27 差異明顯，在第11 天時，其菌落直徑為37.81 mm 和39.95 mm，明顯高于其他真菌菌落，在兩種培養(yǎng)基上初始產(chǎn)孢時間為2.83 d 和3.23 d，與其他菌株相比差異明顯，低于菌株Bbr14 的3.33 d 和3.93 d。

表2 供試菌株在PDA 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀Table 2 Comparison on incubation traits of the test strains on PDA media

表3 供試菌株在SDAY 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀Table 3 Comparison on incubation traits of the test strains on SDAY media

2.2.2 產(chǎn)孢量及萌發(fā)率

菌株生長24 h 后，孢子萌發(fā)率越高，表明孢子萌發(fā)的速度較快。孢子萌發(fā)率的大小表明孢子生命力的強弱，這是菌株營養(yǎng)生長、培養(yǎng)性狀是否良好的重要指標，也是菌株對寄主毒力大小的基本體現(xiàn)。由表4 可知，同一菌株在PDA 培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量大于SDAY 培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量，并且布氏白僵菌Bbr14 的產(chǎn)孢量最大，說明PDA 培養(yǎng)基適合菌株產(chǎn)孢。同一菌株在兩種培養(yǎng)基上的萌發(fā)率相差不大，曲霉A26 的萌發(fā)率在5 株菌株中最高。除此之外，可以看出布氏白僵菌的產(chǎn)孢量明顯大于其他菌株，說明在相同培養(yǎng)條件下，布氏白僵菌的產(chǎn)孢量明顯有利于曲霉、萊氏野村菌、綠僵菌及球孢白僵菌。

2.3 供試菌株對兩種害蟲的室內(nèi)毒力測定

2.3.1 對煙粉虱的毒力測定

在1×108孢子/mL 濃度下，5種菌株對煙粉虱成蟲及若蟲的室內(nèi)毒力如表5 所示，5種菌株對煙粉虱成蟲及若蟲均有較強的致病力。曲霉A26 對煙粉虱成蟲的校正死亡率在第3 天時為40.61%，明顯高于其他菌株，但與菌株Bbr84 和Nr27 差異不明顯(＜5%);在第9 天時死亡率達到最高為84.69%，僵蟲率為91.17%，LT50最小為4.31 d;菌株Bbr84 其次，死亡率為85.86%，僵蟲率為85.07%，LT50為5.19 d;萊氏野村菌Nr27 的校正死亡率為78.90%，僵蟲率為84.86%，LT50為5.34 d，這3 株菌株的校正死亡率差異不明顯，當僵蟲率差異顯著，而布氏白僵菌Bb32 和綠僵菌M23對煙粉虱成蟲的致死率僅為70.36%和72.44%，僵蟲率分別為74.22%和77.34%，LT50為6.77 d和5.78 d，相對其他3種真菌死亡率和僵蟲率均較低。

表4 不同培養(yǎng)基上5種真菌菌株的產(chǎn)孢量測定Table 4 Fungal sporulation strains measurement on different media

表5 供試菌株對煙粉虱的致病力Table 5 Pathogenicity of test strains onB.tabaci

5種真菌對煙粉虱若蟲也表現(xiàn)出了較強的毒力，在第9 天時，曲霉A26 和球孢白僵菌Bbr14 對幼蟲的死亡率分別為77.62%和72.57%，差異不明顯，僵蟲率分別為88.24%和81.52%，差異明顯，且均低于成蟲的累計校正死亡率;而曲霉的LT50為4.87 d 相對于其他菌株為最小。

2.3.2 對褐飛虱的毒力測定

在噴霧量為10 mL 濃度為1×108孢子/mL 的條件下，供試菌株對褐飛虱成蟲及若蟲的室內(nèi)毒力如表6 所示。5 株真菌菌株對褐飛虱成蟲及若蟲致病力的大小都有不同。由表6 可以看出，各處理在第10 天的校正死亡率為49.48%-87.54%，其結(jié)果明顯高于空白對照組的自然死亡率(＜5%)。曲霉A26 對褐飛虱成蟲的致死效果最佳為87.54%，感染率高達90.13%。致死中時僅有4.27d。球孢白僵菌Bbr14 和萊氏野村菌Nr27 對煙粉虱成蟲的致死率分別為80.72%和80.35%，而綠僵菌M23 和布氏白僵菌Bb32 對煙粉虱成蟲的致死率僅為74.18%和73.52%。曲霉A26 對褐飛虱若蟲的致死效果最佳為73.18%，感染率高達87.13%，LT50為5.14 d。球孢白僵菌Bbr14 和萊氏野村菌Nr27 對煙粉虱成蟲的致死率分別為67.39%和65.96%，而布氏白僵菌Bb32 和綠僵菌M23 對煙粉虱成蟲的致死率僅為49.48% 和52.27%，并且同一菌株對褐飛虱的成蟲致死效果優(yōu)于若蟲。

表6 供試菌株對褐飛虱的致病力Table 6 Pathogenicity of the test strains on Nilaparvata lugens(Stal)

3 結(jié)論與討論

本試驗通過對二化螟幼蟲蟲生真菌初步分離和鑒定，對所篩選的5種菌株的菌落顏色、質(zhì)地、菌絲及菌株孢子、孢子梗、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等指標進行初步鑒定其所屬種群，菌株A26 為曲霉，菌株Bbr14 為球孢白僵菌，菌株Bb32 為布氏白僵菌，菌株Nr27 為萊氏野村菌，菌株M23 為綠僵菌，這為下一步利用其防治農(nóng)林害蟲提供一定的理論基礎(chǔ)和參考價值。

菌株形態(tài)學特征往往會因為其生長的營養(yǎng)條件及寄主的不同而不同。本文研究結(jié)果表明，真菌培養(yǎng)時，培養(yǎng)條件的不同導致菌落形態(tài)及長勢不同，SDAY 培養(yǎng)基及PDA 培養(yǎng)基內(nèi)所含營養(yǎng)物質(zhì)不同，導致同一菌株的營養(yǎng)指標(菌落生長速度、初始產(chǎn)孢時間、產(chǎn)孢量)有所不同。同一株菌株在SDAY 培養(yǎng)基上的菌落生長速度均大于PDA 培養(yǎng)基上的生長速度，若培養(yǎng)菌體則SDAY培養(yǎng)基比較合適。各個菌株的產(chǎn)孢量在SDAY 平板培養(yǎng)基上顯著小于PDA 平板培養(yǎng)基，若培養(yǎng)孢子，則PDA 培養(yǎng)基比較合適。林華峰等(2006)認為，在不同溫度與培養(yǎng)基中，25℃溫度條件下，PDA 培養(yǎng)基上，菌落的菌絲增長速度和產(chǎn)孢效果最好。嚴智燕等(2011)研究表明，SDAY 培養(yǎng)基碳源豐富，有利于菌絲的生長，從僵蟲上分離得到的金龜子綠僵菌Ma10，在不同培養(yǎng)基上生長速度差別顯著，這與本實驗結(jié)論相符合。

本試驗結(jié)果表明，5 株菌株對煙粉虱和褐飛虱成蟲、若蟲均表現(xiàn)出一定的毒力，不同菌株侵染致病效果不同，且不同菌株之間差異顯著。其中曲霉A26 對煙粉虱成蟲和若蟲的致死效果最佳分別為84.69%和77.62%，感染率高達91.17%和88.24%。LT50僅有4.31 d 和4.87 d;其次是球孢白僵菌Bbr14 對煙粉虱成蟲和若蟲的致死效果，分別為78.76% 和72.57%，感染率為85.07% 和81.52%，LT50為5.19 d 和6.03 d，這兩種真菌相對于菌株Nr27、M23 和Bb32 的效果明顯較好。同樣，曲霉A26 和球孢白僵菌Bbr14 對褐飛虱也表現(xiàn)出較強的致病力。毒力測定結(jié)果顯示，在第10天時曲霉A26 和球孢白僵菌Bbr14 對褐飛虱成蟲的校正死亡率為87.54% 和80.72%，感染率為90.13%和85.31%，LT50為4.27 d 和5.15 d;對于若蟲的校正死亡率為73.18%和67.39%，感染率為87.13%和82.31%，LT50為5.14 d 和5.76 d，對成蟲的致死效果優(yōu)于若蟲，均高于其他3種真菌。室內(nèi)毒力測定結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，對兩種重要害蟲防治的試驗中發(fā)現(xiàn)，菌株毒力與菌株萌發(fā)率、初始產(chǎn)孢時間具有一定的相關(guān)性。菌株萌發(fā)率越高、初始產(chǎn)孢時間越短，其毒性越強，該結(jié)論與劉玉軍等(2008)在篩選高毒力菌株作用于櫟旋木柄天牛Aphrodisium sauteri 的試驗，以及蔡國貴等(2003)在防治剛竹毒蛾P(guān)antana phyllostachysae的白僵菌優(yōu)良菌株篩選試驗等所得的結(jié)論相符合。這為曲霉和球孢白僵菌的進一步開發(fā)利用提供了應用空間和思路。但是由于目前曲霉有害毒素還未得到全面解釋，所以在應用中還需審慎對待。參照已有研究資料和應用實踐，白僵菌可作為防治農(nóng)業(yè)害蟲的真菌資源，進一步擴展其應用范圍。

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