趙怡楠，高景林，王玉潔，劉俊峰，王錫雪，趙冬香*

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海口 571101;2.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海口 570000;3.海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，海口 571158)

阿維菌素(Averemectin)是一種高效廣譜的大環(huán)內(nèi)酯抗生素類殺蟲殺螨劑(柴方堃等，2012)，作用機(jī)理是通過干擾害蟲神經(jīng)生理活動(dòng)，刺激蟲體產(chǎn)生γ-氨基丁酸，從而阻斷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)信息的傳遞過程，使害蟲中央神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)不能被運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元接受，害蟲迅速麻痹，拒食、緩動(dòng)或不動(dòng)。廣泛應(yīng)用于多種作物防治鱗翅目、雙翅目、同翅目、鞘翅目害蟲、螨類及作物線蟲病(張敏恒，1998)。阿維菌素具有高效、高選擇性、低毒及與環(huán)境相容性好、無公害等優(yōu)點(diǎn)(李衛(wèi)平，2012)，已在世界范圍內(nèi)推廣使用并廣受重視，在中國也得到了廣泛應(yīng)用。

但是隨著人們安全意識(shí)的提高，農(nóng)藥的環(huán)境安全性越來越受到關(guān)注。蜜蜂作為一種傳粉昆蟲和重要的環(huán)境有益生物，農(nóng)藥對(duì)蜜蜂毒性大小，在一定程度上反映了農(nóng)藥的環(huán)境安全性(王成菊等，2006)。王成菊等測(cè)定了阿維菌素及其5種混劑對(duì)意大利成年工蜂Apis mellifera 的毒性，結(jié)果表明10 % 阿維菌素·噠螨靈微乳劑、15 %阿維菌素·丁硫克百威微乳劑對(duì)蜜蜂攝入毒性為劇毒，1.8 %阿維菌素水乳劑、1.7 %吡蟲啉·阿維菌素微乳劑、30.3 %炔螨特·阿維菌素水乳劑、5%阿維菌素·高效氯氰菊酯泡騰片劑對(duì)蜜蜂為高毒，供試六種藥劑對(duì)蜜蜂的接觸毒性均為高毒(王成菊等，2006)。王瀛寰等研究表明，與意大利蜜蜂相比，中華蜜蜂Apis cerana 對(duì)藥劑更敏感，一些對(duì)意大利蜜蜂低毒的藥劑可能會(huì)造成中華蜜蜂的大量中毒死亡(王瀛寰等，2012)。海南中蜂Apis cerana hainan 是海南獨(dú)有的中華蜜蜂種質(zhì)資源(高景林等，2010)，是我國重要的蜜蜂資源。本文利用攝入法和點(diǎn)滴法測(cè)定了阿維菌素及其兩種混劑對(duì)海南中蜂的急性經(jīng)口和接觸毒性，就其對(duì)海南中蜂的毒性進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，評(píng)價(jià)了阿維菌素與噠螨靈混配劑的增效效果。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

海南中蜂成年采集蜂由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所試驗(yàn)蜂場(chǎng)提供。

1.2 試驗(yàn)藥劑

試驗(yàn)藥劑為:1.8 %阿維菌素乳油，桂林集琦生化有限公司;0.6 %阿維菌素·噠螨靈微乳劑(0.6+5)，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司;0.3 %阿維菌素·滅幼脲懸浮劑(0.3+29.7)，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司;15 %噠螨靈乳油，海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)備

試驗(yàn)蜂籠(長為13 cm、寬為6 cm、高為10 cm的鋼制長方體，正面為玻璃板，底部設(shè)有通風(fēng)孔)，移液槍，容量瓶，燒杯，溫濕度記錄儀。

1.4 毒力測(cè)定

在試驗(yàn)的當(dāng)天早晨采集齡期、飼喂?fàn)顩r及健康狀況一致的工蜂，并在溫度25±2℃、相對(duì)濕度50 %-70 % 的黑暗條件下飼養(yǎng)(NEPA，1990)。試驗(yàn)開始前將工蜂饑餓2 h。

需要配置5個(gè)濃度梯度的藥液，并設(shè)1個(gè)空白對(duì)照組(如使用溶劑助溶還需加設(shè)溶劑對(duì)照組)，所有濃度試驗(yàn)組及對(duì)照組設(shè)置3 次重復(fù)，每次重復(fù)10 頭蜜蜂(NEPA，2004)。

經(jīng)口毒性:若供試物可溶于水，則將受試物質(zhì)溶解于蒸餾水制備成試驗(yàn)儲(chǔ)備液，然后將儲(chǔ)備液用蒸餾水稀釋制備成試驗(yàn)藥液，若供試物不溶于水，將受試物質(zhì)溶解于有機(jī)溶劑(如丙酮)制備成試驗(yàn)儲(chǔ)備液，然后將儲(chǔ)備液用蒸餾水稀釋制備成試驗(yàn)藥液。再將試驗(yàn)藥液與50 %蔗糖水以1∶1 混勻。將貯蜂籠內(nèi)的工蜂引入試驗(yàn)蜂籠中，將配置好的試驗(yàn)藥液裝入飼喂器中，每支飼喂器中放入不同質(zhì)量濃度的藥液1.5 mL(OECD，1998;代平禮，2007)。

接觸毒性:以蒸餾水為溶劑稀釋藥液，若供試物不溶于水，可適量加入有機(jī)溶劑(如丙酮)。將海南中蜂低溫麻醉后，用移液槍取1μL 藥液滴于中蜂的前胸背板處，每試驗(yàn)蜂籠內(nèi)用飼喂器加入1.5 mL 50 %蔗糖水(OECD，1998;代平禮，2007)。

1.5 行為觀察

試驗(yàn)開始后觀察蜜蜂的行為活動(dòng)情況，并記錄12 h、24 h、48 h 后蜜蜂死亡情況，描述死亡癥狀及其他異常行為，描述試驗(yàn)過程中與對(duì)照組相比不同的癥狀，如蜜蜂的身體蜷縮、雙翅張開等。當(dāng)蜜蜂身體完全不動(dòng)時(shí)即可判定為死亡。

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1 毒力評(píng)價(jià)

根據(jù)試驗(yàn)期間死亡數(shù)及死亡時(shí)間，采用SPSS 20.0 軟件計(jì)算24 h、48 h 半數(shù)致死濃度值(LC50)、半致死劑量值(LD50)、95 %置信限及相應(yīng)的毒力回歸方程。

參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中關(guān)于農(nóng)藥對(duì)蜜蜂急性經(jīng)口毒性標(biāo)準(zhǔn)(NEPA，1990)，依LC50(48h)劃分為四個(gè)等級(jí):(1)LC50＜0.5 mg a.i./L 為劇毒;(2)0.5 mg a.i./L≤LC50＜20 mg a.i./L 為高毒;(3)20 mg a.i./L≤LC50＜200 mg a.i./L 為中毒;(4)LC50≥200 mg a.i./L為低毒。

農(nóng)藥對(duì)蜜蜂急性接觸毒性標(biāo)準(zhǔn)(NEPA，1990)規(guī)定，蜜蜂接觸藥劑24 h 后，根據(jù)藥劑對(duì)蜜蜂的LD50值的不同劃分為高毒、中毒和低毒3個(gè)級(jí)別:(1)LD50在0.001μg/蜂-2.000μg/蜂之間的為高;(2)LD50在 2.000μg/蜂-11.000μg/蜂之間為中;(3)LD50高 于11.000μg/蜂為低毒。

1.6.2 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

危害商值(hazard quotients，HQ)是經(jīng)合組織(OECD)(2005)、聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)(1989)、歐洲和地中海植物保護(hù)組織(EPPO)(2000)等許多國家和國際組織用以初步判斷農(nóng)藥對(duì)蜜蜂的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。就蜜蜂而言，其HQ 值的計(jì)算公式為:HQ=AR/LD50，式中AR 代表農(nóng)藥田間推薦用量(g/hm2)，LD50是農(nóng)藥對(duì)蜜蜂的急性經(jīng)口或觸殺試驗(yàn)所得值(μg/蜂)。如果HQ 值小于50，則農(nóng)藥對(duì)蜜蜂無害;反之，則認(rèn)為該農(nóng)藥對(duì)蜜蜂存在風(fēng)險(xiǎn)(EPPO，2000)，HQ 值越高，化學(xué)農(nóng)藥對(duì)蜜蜂的風(fēng)險(xiǎn)性越高。

1.6.3 農(nóng)藥混配劑的增效效果評(píng)價(jià)

參照《植物化學(xué)保護(hù)》(趙善歡，2000)中對(duì)農(nóng)藥混配的增效效果評(píng)價(jià)方法，分別計(jì)算各藥劑的相對(duì)毒力指數(shù)(ATI)，混配劑的理論毒力指數(shù)(TTI)以及混劑的共毒系數(shù)(CTC)

以CTC 值作為混劑是否增效的判斷標(biāo)準(zhǔn)，CTC 大于100 的為增效作用，小于80 的為拮抗作用，80-100 的為相加作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 中毒癥狀

阿維菌素及其混劑中毒的海南中蜂，表現(xiàn)為急躁亂飛，身體側(cè)倒，足抽搐。噠螨靈單劑中毒的海南中蜂，表現(xiàn)為足麻痹，身體側(cè)倒，原地打轉(zhuǎn)，而且藥劑濃度越高癥狀越明顯。中毒癥狀與阿維菌素對(duì)昆蟲的作用機(jī)理一致。死亡蜜蜂的癥狀表現(xiàn)為腹部收縮、雙翅張開、喙伸出、身體逐漸發(fā)干并散發(fā)出刺鼻臭味等。

2.2 阿維菌素及其混劑對(duì)海南中蜂的致死效果

如表1 所示，在供試的四種藥劑中，對(duì)海南中蜂的急性經(jīng)口毒性最大的是阿維菌素(LC50為0.006 mg/L)，最小的是阿維菌素·滅幼脲(4.027 mg/L)，阿維菌素·噠螨靈(0.124 mg/L)和噠螨靈(0.270 mg/L)的毒性介于兩者之間。表1 中農(nóng)藥的LC50值隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長逐漸減小，表明供試的幾種農(nóng)藥對(duì)海南中蜂的經(jīng)口毒性具有時(shí)間效應(yīng)。除了阿維菌素·滅幼脲對(duì)海南中蜂的毒性為高毒外，其他三種藥劑都為劇毒。

如表2 所示，對(duì)海南中蜂急性接觸毒性最大的是阿維菌素(LD50為3.430 ng/蜂)，最小的是噠螨靈(164.576 ng/蜂)，阿維菌素·噠螨靈(3.633 ng/蜂)和阿維菌素·滅幼脲(40.711 ng/蜂)的毒性介于兩者之間。表2 中農(nóng)藥的LD50值隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長逐漸減小，表明供試的幾種農(nóng)藥對(duì)海南中蜂的接觸毒性具有時(shí)間效應(yīng)。四種農(nóng)藥對(duì)海南中蜂的急性接觸毒性均為高毒。

2.3 阿維菌素及其混劑對(duì)海南中蜂的危害商值

如表3 所示，供試的四種藥劑中，只有噠螨靈的HQ＜50，即只有噠螨靈對(duì)海南中蜂無害。其他三種農(nóng)藥的HQ 順序?yàn)榘⒕S菌素＞阿維菌素·噠螨靈＞阿維菌素·滅幼脲，即阿維菌素對(duì)海南中蜂的風(fēng)險(xiǎn)性最高，其次是阿維菌素·噠螨靈，阿維菌素·滅幼脲的風(fēng)險(xiǎn)性最低。

表1 阿維菌素及其混劑對(duì)海南中蜂的急性經(jīng)口毒性Table 1 LC50values of avermectins and its mixtures on Apis cerana hainan

表2 阿維菌素及其混劑對(duì)海南中蜂的急性接觸毒性Table 2 LD50values of avermectins and its mixtures on Apis cerana hainan

表3 阿維菌素及其混劑藥對(duì)海南中蜂的危害商值Table 3 HQ values ofavermectins and its mixtures to Apis cerana hainan

2.4 阿維菌素與噠螨靈混配的增效效果評(píng)價(jià)

如表4 所示，在急性經(jīng)口試驗(yàn)中，阿維菌素與噠螨靈混配劑的共毒指數(shù)為681.69，明顯高于100，表現(xiàn)為增效作用。在急性接觸試驗(yàn)中混配劑的共毒指數(shù)為13487.14，明顯高于100，表現(xiàn)為增效作用。

表4 阿維菌素及其混劑藥對(duì)海南中蜂急性毒性的增效效果Table 4 The synergistic effect of avermectins and its mixtures to A.cerana hainan

3 結(jié)論與討論

鄭明奇等(2005)的研究結(jié)果表明18 %阿維菌素水乳劑與10 %阿維菌素·噠螨靈微乳劑對(duì)意大利蜜蜂的經(jīng)口毒性與接觸毒性均為高毒，阿維菌素與噠螨靈混用后毒性增加。王成菊(2006)等的研究表明，10 % 阿維菌素·噠螨靈微乳劑對(duì)意大利蜜蜂的經(jīng)口毒性為劇毒，1.8 %阿維菌素水乳劑對(duì)意大利蜜蜂的經(jīng)口毒性為高毒，這兩種藥劑對(duì)意大利蜜蜂的接觸毒性均為高毒，且混劑的毒性均高于阿維菌素單劑。本文研究了阿維菌素單劑，兩種阿維菌素混劑(阿維菌素·噠螨靈和阿維菌素·滅幼脲)對(duì)海南中蜂的急性經(jīng)口毒性與接觸毒性。結(jié)果表明，經(jīng)口試驗(yàn)中，除了阿維菌素·滅幼脲對(duì)海南中蜂的毒性為高毒外，其他兩種種藥劑都為劇毒，且單劑毒性顯著高于兩種混劑。接觸試驗(yàn)中，三種農(nóng)藥對(duì)海南中蜂的急性接觸毒性均為高毒，且單劑毒性略高于兩種混劑。本研究中單劑的毒性大于混劑，可能是由于選取的劑型為乳油，相對(duì)于水乳劑和微乳劑的毒性更大。而對(duì)意大利蜜蜂經(jīng)口毒性為高毒的阿維菌素及其混劑對(duì)海南中蜂的毒性卻為劇毒，這表明與意大利蜜蜂相比，海南中蜂對(duì)阿維菌素更敏感。本研究也表明阿維菌素及其混劑對(duì)海南中蜂的危害商值都遠(yuǎn)大于50，即對(duì)海南中蜂的風(fēng)險(xiǎn)性很高。因此，應(yīng)盡量避免在養(yǎng)蜂區(qū)或是蜜源植物花期使用阿維菌素及其混配劑，以免蜜蜂中毒死亡。

該試驗(yàn)方法參考國家環(huán)境保護(hù)總局《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》(NEPA，1990)的要求，評(píng)估了上述四種藥劑對(duì)海南中蜂的室內(nèi)急性毒性進(jìn)行。阿維菌素對(duì)海南中蜂的殘留試驗(yàn)、半田間試驗(yàn)、田間試驗(yàn)以及對(duì)幼蟲的毒性試驗(yàn)尚未開展。因此，有必要選取更多不同的阿維菌素混配制劑進(jìn)行深入試驗(yàn)，進(jìn)一步完善阿維菌素對(duì)海南中蜂的毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

References)

Chai FK，Zhang HF，Li W，et al.The control efficiency of the mixture of booster and abamectin on Cnaphalocrocis medialis Guenee［J］.Journal of Agricultural Catastrophology，2012，2(4):17-19.［柴方堃，張慧芳，李雯，等.不同增效劑與阿維菌素混用對(duì)稻縱卷葉螟的防治效果［J］.農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2012，2(4):17-19］

Dai PL，Wang Q，Sun JH，et al.Bioassay of four pesticides on Apis mellifera［J］.Pesticides，2007，46(8):546-547.［代平禮，王強(qiáng)，孫繼虎，等.4種農(nóng)藥對(duì)意大利蜜蜂的毒力測(cè)定［J］.農(nóng)藥，2007，46(8):546-547］

EPPO(European and Mediterranean Plant Protection Organization).Guidelines for the efficacy evaluation of plant protection products，No.170:Side effects on honeybees［J］.IOBC/WPRS Bulletin，2000，23:51-55.

FAO(Food and Agriculture Organization of the United Nations).Revised guidelines on environmental criteria for the registration of pesticides［S］.Part 2，Guidelines for appropriate test procedures.Rome，Italy:FAO.1989.

Gao JL，Zhao DX，Zhou BF，et al.The protection and utilization of Apis cerana hainan［J］.Apliculture of China，2010，61(2):33-34.［高景林，趙冬香，周冰峰，等.海南中蜂資源保護(hù)與利用［J］.中國蜂業(yè)，2010，61(2):33-34］

Li WP.Research progress of avermectin［J］.China Pharmaceuticals，2012，21(19):108-110.［李衛(wèi)平.阿維菌素的研究進(jìn)展［J］.中國藥業(yè)，2012，21(19):108-110］

NEPA.Test criteria for safety assessment of chemical pesticide in environment［J］.Pesticide Science and Administration，1990，2:1-5.［國家環(huán)境保護(hù)總局.化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，1990，2:1-5］

NEPA.Test criteria for safety assessment of chemical pesticide in environment［J］.Pesticide Science and Administration，1990，3:3-5［國家環(huán)境保護(hù)總局.化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，1990，3:3-5］

NEPA.Test criteria for safety assessment of chemical pesticide in environment［J］.Pesticide Science and Administration，1990，4:4-9［國家環(huán)境保護(hù)總局.化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，199，4:4-9］

NEPA.Chemical testing method(2004)［M］.Beijing:China Environmental Science Press.2004，215-219.［國家環(huán)境保護(hù)總局《化學(xué)品測(cè)試方法編委會(huì)》.化學(xué)品測(cè)試方法(2004)［M］.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社，2004，215-219］

OECD(Organization for Economic Co-operation and Development).OECD Guidelines for the testing of chemicals(Honeybees，Acute Oral Toxicity Test)［S］.OECD/OCED，1998，1-8.

OECD(Organization for Economic Co-operation and Development).OECD guidance for industry data submissions on plant protection productsand their active substances(Revision 2)［S］.Appendix 8，Part 3，Ecotoxicological Studies and Risk Assessment.Paris，F(xiàn)rance:OECD，2005.

Wang CJ，Qiu LH，Zheng MQ，et al.Safety evaluation of abamectin and its mixtures to honey bees(Apis mellifera L.)［J］.Journal of Agro-Environment Science，2006，25(1):229-231.［王成菊，邱立紅，鄭明奇，等.阿維菌素及其混配制劑對(duì)蜜蜂的安全性評(píng)價(jià)［J］.農(nóng)藥環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2006，25(1):229-231］

Wang YH，Zhang YF，Zhang XU，et al.Oral toxicity of five pesticides to Apis cerana cerana and Apis mellifera［J］.Chinese Journal of Pesticide Science，2012，14(4):453-456.［王瀛寰，張艷峰，張旭，等.五種農(nóng)藥對(duì)中華蜜蜂和意大利蜜蜂工蜂的經(jīng)口毒性比較［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14(4):453-456］

Zhang MH，1998.Novel efficient broad-spectrum insecticide miticide avermectin［J］.Pesticides，37(3):36-37.［張敏恒，1998.新型高效廣譜殺蟲殺螨劑阿維菌素［J］.農(nóng)藥，37(3):36-37］

Zheng MQ，Qiu LH，Wang CJ，et al.Safety evaluation of pesticides containing Avermectin or Emamectin Benzaoate［J］.Journal ofAnhui Agriculture Science，2005，33(6):980-981.［鄭明奇，邱立紅，王成菊，等.9種含阿維菌素或甲氨基阿維菌素的農(nóng)藥對(duì)蜜蜂安全性評(píng)價(jià)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，33(6):980-981］

Zhao SH.Chemical Protection of Plants［M］.Beijing:Chinese Agriculture Press，2000，6.［趙善歡.植物化學(xué)保護(hù)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2000，6］