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      HPLC測定甘草酸二銨原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

      2014-12-16 08:27:56崔素梅蔣艷霞霍建富山西康寶生物制品股份有限公司長治046011
      關(guān)鍵詞:二銨甘草酸雜質(zhì)

      崔素梅,曹 方,蔣艷霞,霍建富(山西康寶生物制品股份有限公司,長治 046011)

      甘草酸二銨是從甘草中提取的a體甘草次酸衍生物,具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗病毒、保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)免疫、改善肝功能等多種作用。近年來隨著臨床研究的不斷深入,其應(yīng)用范圍不斷拓寬[1],臨床價(jià)值極大。因此甘草酸二銨制劑的質(zhì)量,密切關(guān)系到人民群眾的用藥安全,甘草酸二銨原料藥作為制劑的源頭,把好質(zhì)量關(guān)十分必要。

      甘草酸二銨原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括四方面,檢查項(xiàng)通常應(yīng)考慮安全性、有效性和純度三方面的內(nèi)容。有關(guān)物質(zhì)的檢測作為檢查項(xiàng)下的重要指標(biāo),對甘草酸二銨原料藥的質(zhì)量控制起到十分重要的作用。甘草酸二銨原料藥的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[2]中并未收入有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)目,但由于本品組成復(fù)雜,為保證產(chǎn)品批間質(zhì)量的一致性和安全性,有必要建立一種專屬性強(qiáng)、靈敏度高的有關(guān)物質(zhì)的檢測方法,并確定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

      1 儀器與試藥

      儀器:島津LC-10ATvp高效液相色譜儀,SPD-M10Avp紫外檢測器。色譜柱:Apollo C18柱(250 mm ×4.6 mm,φ5 μm)。進(jìn)樣量:20 μl,試驗(yàn)試劑:乙腈為色譜級,磷酸二氫鉀、磷酸為分析純,水為純化水。

      試藥:原料藥樣品批號:130401、130402和130403,均為山西康寶生物制品股份有限公司產(chǎn)品。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 色譜條件的建立

      參照文獻(xiàn)[3,4]的高效液相色譜法建立了甘草酸二銨高效液相色譜條件。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.0)(40∶60)為流動(dòng)相;檢測波長252 nm。理論塔板數(shù)按甘草酸二銨峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000,在此液相色譜條件下主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度良好,符合藥典要求,使甘草酸二銨與其可能存在的雜質(zhì)及降解產(chǎn)物達(dá)到完全分離。

      2.2 溶液的制備

      供試品溶液的制備:精密稱取甘草酸二銨原料25 mg,置50 ml容量瓶中,精密加入流動(dòng)相制成含量為500 μg/ml的溶液,搖勻,即得。

      自身10%對照溶液的制備:精密量取供試品溶液稀釋10倍,即得含量為50 μg/ml的溶液,搖勻。

      測定法:精密量取對照溶液20 μl注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測靈敏度,使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10%-25%。再精密量取對照液和供試液各20 μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍;供試品色譜圖中如顯雜質(zhì)峰,各雜質(zhì)的峰面積之和不得大于對照溶液主成分峰面積的10.0%。

      2.3 方法學(xué)研究

      2.3.1 波長的選擇 精密稱取甘草酸二銨適量,加流動(dòng)相溶解并稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛龋米贤夥止夤舛扔?jì)按分光光度法[3]在200-400 nm掃描,結(jié)果甘草酸二銨在252 nm±2 nm有最大吸收;由于得不到雜質(zhì)對照品,并且在預(yù)試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),在此波長處用HPLC法檢測雜質(zhì)明顯,因此我們將測定波長選為252 nm。

      2.3.2 流動(dòng)相的選擇 分別使用乙腈、0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)pH值為3.0±0.05),按不同比例配制流動(dòng)相,42∶58為流動(dòng)相1;35∶65為流動(dòng)相2;40∶60為流動(dòng)相3。

      結(jié)果顯示,選用流動(dòng)相1,出峰太早,甘草酸二銨與雜質(zhì)峰未完全分離??紤]改變流動(dòng)相極性,得流動(dòng)相2,采用流動(dòng)相2顯示,甘草酸二銨與雜質(zhì)完全分離,但出峰時(shí)間太晚。繼續(xù)改變乙腈的比例得流動(dòng)相3,結(jié)果主峰保留時(shí)間合適,主峰與雜質(zhì)峰分離良好。確定流動(dòng)相條件為流動(dòng)相3。

      2.3.3 空白溶劑試驗(yàn) 精密吸取流動(dòng)相20 μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,結(jié)果顯示流動(dòng)相不影響有關(guān)物質(zhì)的檢查。

      2.3.4 專屬性試驗(yàn) 精密稱取甘草酸二銨原料25 mg,加流動(dòng)相溶解并稀釋至50 ml,作為破壞性試驗(yàn)的貯備溶液。分別以下列條件試驗(yàn):①酸破壞試驗(yàn):量取甘草酸二銨貯備溶液2 ml,加1 mol/L鹽酸1 ml,在熱水浴中放置3 h,放涼后用1 mol/L NaOH中和,作為酸破壞樣品溶液。②堿破壞試驗(yàn):量取甘草酸二銨貯備溶液2 ml,加1 mol/L氫氧化鈉1 ml,在熱水浴中放置3 h,放涼后用1 mol/L鹽酸中和,作為堿破壞樣品溶液。③氧化破壞試驗(yàn):量取甘草酸二銨貯備溶液2 ml,加30%雙氧水1 ml,放置60 min,然后加熱少許,破壞掉溶液中殘余的雙氧水,放涼后作為氧破壞樣品溶液。④光照破壞試驗(yàn):量取甘草酸二銨貯備溶液2 ml,在(4 500±500)Lx照度下照射6 h。⑤高溫破壞試驗(yàn):量取甘草酸二銨貯備溶液適量,在沸水浴中加熱3 h,放涼后作為高溫破壞樣品溶液。分別量取上述溶液各20 μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍。氧化破壞試驗(yàn)條件下,圖譜中未見有新雜質(zhì)峰產(chǎn)生,原雜質(zhì)含量增加。其他試驗(yàn)條件下,圖譜中未見明顯的新雜質(zhì)峰產(chǎn)生,原雜質(zhì)數(shù)目和含量未見增加。

      經(jīng)破壞試驗(yàn)表明:本品在酸性、堿性、光照、高溫條件下較穩(wěn)定;在氧化條件下不穩(wěn)定。各供試液中雜質(zhì)與主峰的分離良好,分離度符合要求。

      2.3.5 檢出限 取2.2項(xiàng)下的供試品溶液,進(jìn)行逐級稀釋,進(jìn)樣,記錄色譜圖,至主峰峰高約為基線噪音的3倍時(shí),此進(jìn)樣量為本品的最低檢出限。結(jié)果 表明:甘草酸二銨最低檢測濃度為0.1 μg/ml,計(jì)算其最低檢出量為2.0 ng。

      2.3.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品適量按上述測定方法配制成濃度為500 μg/ml的溶液,在室溫下分別放置 0,4,8,12,24 h,精密量取 20 μl注入色譜儀中,每個(gè)時(shí)點(diǎn)重復(fù)進(jìn)樣3次,記錄色譜圖,結(jié)果見表1。

      表1 甘草酸二銨溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The stability results of diammonium glycyrrhizanate solution

      結(jié)論:甘草酸二銨主峰峰面積基本一致,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.5%,未見有新雜質(zhì)出現(xiàn),說明本品溶液在室溫下至少24 h之內(nèi)穩(wěn)定,可滿足含量測定的需要。

      2.3.7 精密度試驗(yàn) 取供試品適量按上述測定方法配制成濃度為500 μg/ml的溶液,精密量取20 μl注入色譜儀中,連續(xù)進(jìn)樣5次,記錄色譜圖,結(jié)果顯示甘草酸二銨主峰峰面積RSD值小于1.0%(見表2),說明本法精密度良好。

      表2 甘草酸二銨重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The repeatability resu lts of diammonium glycyrrhizanate solution

      2.3.8 有關(guān)物質(zhì)測定 取2.2項(xiàng)下配制的供試品溶液和對照品溶液,按2.2項(xiàng)下的測定方法測定,供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰,單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得超過5.0%,除單個(gè)雜質(zhì)峰外,其他雜質(zhì)峰面積之和不得超過 5.0%(見圖1,2)。

      圖1 甘草酸二銨溶液有關(guān)物質(zhì)檢查色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatograms of the related substances of diammonium glycyrrhizanate solution

      圖2 甘草酸二銨溶液有關(guān)物質(zhì)檢查10%自身對照色譜圖Figure 2 High performance liquid chromatograms of the related substances of 10%diammonium glycyrrhizanate solution

      2.3.9 三批樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果 取三批樣品按2.2項(xiàng)下的方法測定,結(jié)果顯示三批樣品的最大雜質(zhì)為3.40%,其他雜質(zhì)總和為3.35%(見表3),可見增加有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)目很有必要,3批樣品的有關(guān)物質(zhì)均小于10.0%,考慮到本品的起始原料為中藥材的提取物以及將來生產(chǎn)的實(shí)際,我們標(biāo)準(zhǔn)中限定有關(guān)物質(zhì)為不得高于10%。

      表3 三批樣品中有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果Table 3 The test results of the related substances in three batches of samples

      3 討論

      用HPLC法測定甘草酸二銨原料藥的有關(guān)物質(zhì),用紫外分光光度法掃描,確定檢測波長為252 nm,試驗(yàn)比較了多種比例的流動(dòng)相,以乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.0)(40∶60)為流動(dòng)相;分離效果較佳,保留時(shí)間適宜,分離度大于1.5。該方法簡便可靠,精密度高,分離度好,專屬性強(qiáng),可用于甘草酸二銨原料藥的有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制。

      由于該產(chǎn)品是從中藥甘草中提取的,組成復(fù)雜,雜質(zhì)種類較多,含量高,采用自身10%對照法檢測有關(guān)物質(zhì)有利于控制產(chǎn)品質(zhì)量。3批樣品的檢測,有關(guān)物質(zhì)均小于10.0%,我們標(biāo)準(zhǔn)中限定有關(guān)物質(zhì)為不得高于10%。

      [1]趙蓉,呂凌.甘草酸二銨藥理研究和臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2008 4(3):31-36.

      [2]國家藥品監(jiān)督管理局.家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:人民衛(wèi)生出版社,2004:84-85.

      [3] 國家藥典委員會(huì).中國藥典二部[M].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:29-31,23-24.

      [4]張敏娟.RP-HPLC測定注射用復(fù)方甘草酸苷中甘草酸銨含量和有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析,2008,28(5):798-800.

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