張胡彬,何健葉,王志耕,梅林,薛秀恒
(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院,安徽農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥,230036)
香腸后熟發(fā)酵過程中,反應(yīng)蛋白質(zhì)分解程度的“揮發(fā)性鹽基氮”(TVB-N)和脂肪氧化程度的“過氧化值”(POV)是決定產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵理化指標(biāo)。但是,這兩項(xiàng)理化指標(biāo)的檢測(cè)存在樣品前處理較復(fù)雜、分析操作要求較高、耗時(shí)較長等不足,不能滿足生產(chǎn)企業(yè)對(duì)大批產(chǎn)品快速檢測(cè)的需求。探索一種簡(jiǎn)單、便捷、無損的檢測(cè)方法具有實(shí)際應(yīng)用意義。
電子鼻是一種由具有部分選擇性的化學(xué)傳感器陣列和適當(dāng)?shù)哪J阶R(shí)別系統(tǒng)組成的能識(shí)別簡(jiǎn)單或復(fù)雜氣味的儀器[1]。相比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段,電子鼻技術(shù)表現(xiàn)出了諸多優(yōu)勢(shì):前處理方便、無損檢測(cè)、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、結(jié)果客觀[2],而且還能通過化學(xué)計(jì)量統(tǒng)計(jì)的方式進(jìn)行定量分析[3]。自1990年代興起以來,國內(nèi)外對(duì)電子鼻相關(guān)技術(shù)的研究一直十分活躍。在食品行業(yè)中,利用電子鼻檢測(cè)果蔬成熟度、評(píng)價(jià)肉類新鮮度、識(shí)別香精香氣成分、審評(píng)產(chǎn)品等級(jí)已有系列研究報(bào)道[4-10],運(yùn)用電子鼻研究不同后熟時(shí)期香腸的特征氣味指紋與理化品質(zhì)指標(biāo)(TVB-N、POV)的相關(guān)性,并通過氣味指紋識(shí)別模型對(duì)生產(chǎn)中的產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行快速檢測(cè)尚未見報(bào)道。
本試驗(yàn)通過使用德國Airsense PEN3型電子鼻研究香腸在后熟發(fā)酵工藝過程中的風(fēng)味變化,并通過統(tǒng)計(jì)分析的方法建立香腸風(fēng)味變化與TVB-N和POV這兩個(gè)理化品質(zhì)指標(biāo)變化的聯(lián)系,并在此基礎(chǔ)上建立氣味指紋識(shí)別預(yù)測(cè)模型,以達(dá)到通過嗅探香腸氣味指紋快速檢測(cè)確定香腸TVB-N和POV值的目的。
冷鮮肉,購自合肥市清溪路大潤發(fā)超市;膠原蛋白腸衣,保定,唯新腸衣有限公司;其他所用試劑均為分析純。
PEN3型電子鼻(配Winmuster1.6.2氣味指紋分析處理軟件),德國Airsense公司;恒溫恒濕箱,合肥華德利公司;R-3絞肉機(jī),蘇州正元精密機(jī)械公司。
1.3.1 香腸制作工藝
將冷鮮肉分為肥肉和瘦肉兩部分,肥肉放入-4℃冰箱,冷凍2 h。使用篩板孔徑為1 cm的絞肉機(jī)將瘦肉及冷凍過的肥肉絞成肉丁。按肥瘦比3∶7混合,同時(shí)按20 mL/kg的比例加入白酒。按照配方(表1)加入其他各種配料?;靹虿㈧o置2 h后,用灌腸機(jī)灌入膠原蛋白腸衣[11-12]。香腸懸掛于15℃,RH=40%的恒溫恒濕箱中后熟發(fā)酵,待電子鼻檢測(cè)。
1.3.2 氣味指紋的采集
在香腸后熟發(fā)酵工藝過程中的第 0、2、6、11、15天,分別取樣,使用電子鼻進(jìn)行氣味指紋采集。電子鼻工作條件設(shè)置為:傳感器清洗時(shí)間120 s、傳感器歸零時(shí)間 10 s、樣品準(zhǔn)備時(shí)間 5 s、進(jìn)樣時(shí)間 90 s、進(jìn)樣 流量 300 mL/min[9]。
表1 香腸配方表Table 1 Formula of Chinese sausage
1.3.3 檢測(cè)樣處理
取待測(cè)香腸樣品,剪碎成約0.5 cm3的小塊,每個(gè)樣取10 g,分裝于規(guī)定體積的頂空進(jìn)樣瓶中(除頂空體積實(shí)驗(yàn)組外頂空瓶體積均為100 mL),5個(gè)平行樣分為一組。置于規(guī)定溫度條件下(除溫度試驗(yàn)組外均為15℃),經(jīng)過規(guī)定時(shí)間富集后(除富集時(shí)間試驗(yàn)組外均為15 min)進(jìn)行電子鼻檢測(cè),取進(jìn)樣的第55~60秒(取樣時(shí)間試驗(yàn)組除外)的氣味指紋數(shù)據(jù)作為有效數(shù)據(jù)。
1.3.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
(1)進(jìn)樣溫度:進(jìn)樣溫度分為-5℃(冰箱)、15℃(常溫)、35℃(水浴)、55℃(水浴)4組采集氣味指紋數(shù)據(jù)。
(2)頂空生成體積:采用100、250、500 mL的頂空進(jìn)樣瓶采集氣味指紋數(shù)據(jù)。
(3)氣體富集時(shí)間:氣體分別富集15、30、60 min后采集氣味指紋數(shù)據(jù)。
(4)取樣時(shí)間:取進(jìn)樣的第30~35 s、55~60 s、80~85 s分別采集氣味指紋數(shù)據(jù)。
1.3.5 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)的測(cè)定
在香腸后熟工藝過程中的第0、2、6、11、15 天,分別取樣,按GB/T5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中微量擴(kuò)散法對(duì)樣品中的TVB-N值進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果以每100 g香腸中所含氮的質(zhì)量(g)表示。
1.3.6 過氧化值(POV)的測(cè)定
在香腸后熟工藝過程中的第0、2、6、11、15 天,分別取樣,按GB/T5538-2005《動(dòng)植物油脂過氧化值測(cè)定》所述方法對(duì)樣品中的POV值進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果以每1 000 g香腸中活性氧的毫克當(dāng)量數(shù)表示。
1.3.7 數(shù)據(jù)處理
試驗(yàn)數(shù)據(jù),采用Spss18.0軟件進(jìn)行方差和回歸分析。
2.1.1 TVB-N值的變化
試驗(yàn)期內(nèi),TVB-N值變化參見圖1。
圖1 香腸在發(fā)酵過程中TVB-N值變化趨勢(shì)Fig.1 TVB-N change trend of Chinese sausage during fermentation
由圖1可知,香腸在發(fā)酵過程中,隨發(fā)酵時(shí)間的增加,TVB-N值呈逐漸上升趨勢(shì)。前6天上升趨勢(shì)較快,而6 d之后上升趨勢(shì)開始減緩。這可能是由于發(fā)酵前期香腸中的水分含量較高,微生物活動(dòng)較為活躍,引起TVB-N值的快速上升,而隨著干燥脫水,微生物活動(dòng)受抑制,TVB-N值上升開始趨緩。
2.1.2 POV值的變化
試驗(yàn)期內(nèi),香腸的POV值變化參見圖2。
圖2 香腸在發(fā)酵過程中POV值的變化趨勢(shì)Fig.2 Peroxide vale change trend of Chinese sausage during fermentation
從圖2中可以看出,在香腸發(fā)酵的前6天,POV值基本不變,從第6天開始,POV值上升較快。表明,在試驗(yàn)條件下,第6天開始,脂肪成分開始被氧化分解,引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng),產(chǎn)生過氧化自由基。
2.2.1 電子鼻傳感器陣列對(duì)香腸氣味的響應(yīng)
PEN3電子鼻有一個(gè)具有10個(gè)金屬氧化物傳感器的陣列系統(tǒng),其中的每一個(gè)傳感器都會(huì)對(duì)所通過陣列的氣體中某一類物質(zhì)產(chǎn)生特征響應(yīng)。該響應(yīng)值用樣品氣的電導(dǎo)率(G)與背景空氣的電導(dǎo)率(G0)之比(G/G0或G0/G)來表示。將10個(gè)傳感器的電導(dǎo)率之比(G/G0或G0/G)集合起來就形成了該種物質(zhì)特征性的氣味指紋[5]。圖3為在香腸發(fā)酵過程中的第0、2、6、11、15 天傳感器陣列響應(yīng)圖。圖中每一條線分別代表一個(gè)傳感器的電導(dǎo)率之比G/G0(G0/G)隨進(jìn)樣時(shí)間變化趨勢(shì)。由圖中可以看出隨著發(fā)酵時(shí)間的變化,香腸氣味指紋圖譜發(fā)生了顯著的變化,說明電子鼻可以有效地識(shí)別不同發(fā)酵時(shí)期的香腸產(chǎn)品。同時(shí)各傳感器響應(yīng)值存在一定差異,但隨著發(fā)酵的進(jìn)行差異度漸漸縮小。
圖3 PEN3電子鼻傳感器陣列對(duì)發(fā)酵天數(shù)的香腸氣味的響應(yīng)圖Fig3 Response of PEN3 electronic nose sensor array to smell of Chinese sausage in different fermentation time
2.2.2 電子鼻進(jìn)樣條件的優(yōu)化
在用電子鼻測(cè)量香腸氣味時(shí),進(jìn)樣樣品溫度、樣品的頂空體積、樣品的富集時(shí)間以及氣味指紋數(shù)據(jù)的采集時(shí)間這些因素對(duì)采集的氣味指紋產(chǎn)生影響,降低所建立模型的區(qū)分度和識(shí)別能力,增加了系統(tǒng)誤差。
2.2.2.1 進(jìn)樣溫度的優(yōu)化
使用方差分析法,分析不同進(jìn)樣溫度(-5℃、15℃、35℃、55℃)對(duì)電子鼻傳感器陣列響應(yīng)值數(shù)據(jù)變化的影響,方差分析結(jié)果參見表2。表2中10根傳感器的P值全部小于0.001,說明進(jìn)樣溫度不同對(duì)所有傳感器的響應(yīng)值都有極顯著的影響,故有必要對(duì)進(jìn)樣溫度進(jìn)行優(yōu)化。
分析比較不同進(jìn)樣溫度條件下,電子鼻傳感器陣列對(duì)不同發(fā)酵天數(shù)(第 0、2、6、11、15 天)的香腸氣味的區(qū)分能力。分析結(jié)果參見表3,發(fā)酵第0、2、6、11、15天香腸的風(fēng)味具有極顯著的差異,觀察F值,發(fā)現(xiàn)進(jìn)樣溫度在35℃的時(shí)候具有最大的F值,說明在進(jìn)樣溫度為35℃時(shí),樣品組間離差最大,組內(nèi)離差最小。說明進(jìn)樣溫度為35℃時(shí)電子鼻傳感器陣列對(duì)發(fā)酵天數(shù)不同的香腸的區(qū)分能力達(dá)到最高,故選定35℃為電子鼻進(jìn)樣溫度。
表2 各傳感器響應(yīng)值受進(jìn)樣溫度影響產(chǎn)生變化的方差分析Table 2 Variance analysis of each sensor response value changing affected by the sample temperature
表3 采用不同進(jìn)樣溫度時(shí)傳感器陣列對(duì)不同發(fā)酵天數(shù)香腸氣味區(qū)分能力的比較Table 3 The comparison of separating capacity of sensors array to the smell of different fermentation time under different sampling temperature
2.2.2.2 樣品頂空體積的優(yōu)化
使用方差分析法,分析不同頂空生成體積(100、250、500 mL)對(duì)電子鼻傳感器陣列響應(yīng)值數(shù)據(jù)變化的影響,方差分析結(jié)果參見表4。表4中僅S6傳感器響應(yīng)值受頂空體積變化影響顯著,S6傳感器主要對(duì)CH4敏感,考慮到CH4在香腸香氣中含量較低,可以忽略S6傳感器對(duì)整體結(jié)果的影響。而其余各傳感器的P值均大于0.05。說明不同頂空體積組的組內(nèi)差異較大,而組間差異較小,頂空體積的變化對(duì)傳感器陣列總響應(yīng)值的影響不顯著。為進(jìn)樣方便,選取100 mL頂空體積瓶為測(cè)量瓶。
表4 各傳感器響應(yīng)值受進(jìn)樣頂空體積影響產(chǎn)生變化的方差分析Table 4 Variance analysis of each sensor response value changing affected by headspace volume
2.2.2.3 樣品富集時(shí)間的優(yōu)化
使用方差分析法,分析不同樣品富集時(shí)間(15 min、30 min、60 min)對(duì)電子鼻傳感器陣列響應(yīng)值數(shù)據(jù)變化的影響,方差分析結(jié)果參見表5。
表5 各傳感器響應(yīng)值受樣品富集時(shí)間影響產(chǎn)生變化的方差分析Table 5 Variance analysis of each sensor response value changing affected by accumulation time
表5 結(jié)果表明,1,2,3,5,6,7,9 號(hào)共 7 根傳感器的P值小于0.05,說明樣品富集時(shí)間對(duì)傳感器陣列中大多數(shù)傳感器的響應(yīng)值均可產(chǎn)生顯著影響,故有必要對(duì)樣品富集時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。
分析比較不同樣品富集時(shí)間條件下,電子鼻傳感器陣列對(duì)不同發(fā)酵天數(shù)(第0、2、6、11、15天)的香腸氣味的區(qū)分能力,結(jié)果參見表6。觀察F值,發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣品富集時(shí)間為30 min時(shí)F最大,說明當(dāng)樣品富集時(shí)間為30 min時(shí)組間區(qū)分度最大,說明樣品富集時(shí)間為30 min時(shí)傳感器陣列對(duì)發(fā)酵天數(shù)不同的香腸的區(qū)分能力最高,故選定樣品的富集時(shí)間為30 min。
2.2.2.4 數(shù)據(jù)采集時(shí)間的確定
使用方差分析法,分析不同數(shù)據(jù)采集時(shí)間(30~35 s、55 ~60 s、80 ~85 s)對(duì)電子鼻傳感器陣列響應(yīng)值數(shù)據(jù)變化的影響,方差分析結(jié)果參見表7。發(fā)現(xiàn)除S4傳感器外,其他傳感器的P值全部大于0.05。由于S4傳感器主要對(duì)H2敏感,考慮到H2在香腸香氣中含量較低,故可以忽略S4傳感器對(duì)整體結(jié)果的影響。說明3組數(shù)據(jù)采集時(shí)間對(duì)氣味指紋數(shù)據(jù)的影響不顯著。觀察傳感器陣列響應(yīng)圖發(fā)現(xiàn),本試驗(yàn)中,傳感器響應(yīng)值從第50秒已經(jīng)開始趨于穩(wěn)定,為提高測(cè)試效率,故選擇55~60 s為氣味指紋采集時(shí)間。
表6 不同樣品富集時(shí)間條件下傳感器陣列對(duì)不同發(fā)酵天數(shù)香腸氣味區(qū)分能力的比較Table 6 The comparison of separating capacity of sensors array to the smell of different fermentation time under different accumulation time
2.2.3 氣味指紋識(shí)別模型的建立
利用的與PEN3電子鼻所配套的WinMuster1.6.2數(shù)據(jù)處理軟件,對(duì)使用上述優(yōu)化后的進(jìn)樣參數(shù)收集到的氣味指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。通過使用主成分分析(PCA)和線性判斷分析(LDA),對(duì)用10個(gè)維度表示的香腸氣味指紋復(fù)合數(shù)據(jù)進(jìn)行降維和轉(zhuǎn)換,最終擬合成“第一主成分”和“第二主成分”2個(gè)指標(biāo)表示的方式,并在二維散點(diǎn)圖上表示出來,分析結(jié)果如圖4和圖5所示。再通過偏最小二乘法(PLS)將氣味指紋數(shù)據(jù)和實(shí)際測(cè)量的指標(biāo)值擬合,最終形成一個(gè)記錄有香腸發(fā)酵不同時(shí)期氣味指紋和與之相對(duì)應(yīng)指標(biāo)值的識(shí)別模型,模型分析結(jié)果如圖6所示。
表7 各傳感器響應(yīng)值受數(shù)據(jù)采集時(shí)間影響產(chǎn)生變化的方差分析Table 7 Variance analysis of each sensor response value changing affected by data-collection interval
圖5 不同發(fā)酵時(shí)間香腸氣味指紋的LDA分析Fig.5 LDA analysis of flavor finger-print of Chinese traditional sausage in different fermentation time
從圖4 PCA分析圖中可以看出,在主成分分析(PCA)中,第一主成分(PC1,橫坐標(biāo))和第二主成分(PC2,縱坐標(biāo))的區(qū)分貢獻(xiàn)率分別達(dá)到92.91%和5.01%,兩者合計(jì)達(dá)到97.92%,即可以用 PC1和PC2解釋的氣味差異達(dá)到97.92%,大于90%。說明完全可以用PC1和PC2來代表香腸的香氣差異。由圖還可知,0~11 d期間各組的區(qū)分度均大于0.900,氣味指紋數(shù)據(jù)區(qū)分良好。但第11天和第15天2組的區(qū)分度顯著降低,表明,香腸發(fā)酵前期,是風(fēng)味形成,香氣成分變化較大階段,而第11天后,香腸進(jìn)入發(fā)酵后期,特征風(fēng)味基本形成,香腸香氣的主體成分趨于穩(wěn)定。
圖6 不同發(fā)酵時(shí)間香腸氣味指紋的PLS模型分析Fig.6 PLS Model analysis of flavor finger-print of Chinese traditional sausage in different fermentation time
從圖5中可以看出,線性判別式函數(shù)LD1和LD2的貢獻(xiàn)率分別為86.93%和10.39%,兩者合計(jì)達(dá)到97.32%,大于90%,說明判別函數(shù)LD1和LD2可以較好地區(qū)分氣味指紋差異。
相比PCA分析,LDA分析的各組間的區(qū)分度明顯提高,可以更有效地區(qū)分不同后熟天數(shù)的香腸。這是因?yàn)樵贚DA分析中所構(gòu)造的判別函數(shù)是由原始變量經(jīng)線性組合能夠最大限度區(qū)分不同的樣本集,在降低數(shù)據(jù)空間維數(shù)的同時(shí),也最大限度地減少了信息丟失。觀察發(fā)現(xiàn),在整個(gè)后熟過程中,第一主成分的增長和后熟天數(shù)的增長成正相關(guān)趨勢(shì)。說明后熟天數(shù)的變化和氣味指紋的變化存在相關(guān)性。
圖6是用偏最小二乘法建立的PLS預(yù)測(cè)模型分析圖,可以觀察到各觀測(cè)日的氣味指紋數(shù)據(jù)區(qū)分度良好,差異主要表現(xiàn)在第一主成分(PC1)上,并隨著天數(shù)的增加成明顯的線性增長趨勢(shì)。PC1的區(qū)分貢獻(xiàn)率達(dá)到 97.29%,PC2的貢獻(xiàn)率為 2.29%,合計(jì)99.583%。說明在香腸后熟過程中,第一主成分的變化與后熟天數(shù)具有相關(guān)性。通過測(cè)量后熟發(fā)酵過程香腸的氣味指紋,并代入該模型分析,PLS預(yù)測(cè)模型就可以根據(jù)其香氣第一主成分與后熟天數(shù)的相關(guān)性,給出對(duì)后熟天數(shù)的判定。再將實(shí)測(cè)各天的TVB-N值和POV值指標(biāo)數(shù)據(jù)賦值給各天的PLS氣味指紋模型,這樣就可以達(dá)到利用PLS模型快速檢測(cè)指標(biāo)值變化的目的。
選取與建立識(shí)別模型同批次香腸樣品,分別選取第0,2,6,11,15 觀測(cè)日樣品的氣味指紋各5 個(gè),共25個(gè),組成氣味指紋預(yù)測(cè)模型的訓(xùn)練集。將訓(xùn)練集中的氣味指紋代入識(shí)別模型,記錄PLS模型給出的TVBN和POV的預(yù)測(cè)值,并與實(shí)際值進(jìn)行比較,計(jì)算預(yù)測(cè)誤差,結(jié)果如表8、表9所示。發(fā)現(xiàn)PLS預(yù)測(cè)模型對(duì)TVB-N值的預(yù)測(cè)較為精確,平均相對(duì)誤差僅為2.14%,而對(duì)POV的預(yù)測(cè)偏差稍大,平均相對(duì)誤差達(dá)到8.99%。用二維散點(diǎn)圖表示預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的關(guān)系,通過線性擬合,訓(xùn)練集的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值具有很好的線性相關(guān)性,TVB-N值和POV值的R2分別為0.994 2和0.991 1,擬合度良好(圖7、圖8)。說明使用所構(gòu)建的PLS預(yù)測(cè)模型,可以對(duì)訓(xùn)練集中的香腸樣品的指標(biāo)值完成準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。將訓(xùn)練集中的氣味指紋數(shù)據(jù)按發(fā)酵天數(shù)并入PLS模型中,完成對(duì)模型的訓(xùn)練。
表8 訓(xùn)練集預(yù)測(cè)誤差分析表Table 8 Error analysis of training set
表9 測(cè)試集預(yù)測(cè)誤差分析表Table 9 Error analysis of test set
再取與建立模型所用香腸不同批次的香腸,在其發(fā)酵過程中任意取25個(gè)氣味指紋,作為模擬測(cè)試集。代入PLS預(yù)測(cè)模型,同時(shí)進(jìn)行化學(xué)測(cè)試,比較預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的差異,計(jì)算測(cè)試誤差。結(jié)果如表9所示,PLS模型對(duì)TVB-N值和POV值預(yù)測(cè)的平均相對(duì)誤差為5.59%和11.96%,相比訓(xùn)練集誤差有所增大。對(duì)POV值預(yù)測(cè)的平均相對(duì)誤差超過10%,這可能是由于樣品該指標(biāo)值本身較小,受化學(xué)測(cè)試存在的系統(tǒng)誤差的影響較大,導(dǎo)致相對(duì)誤差增大。但其標(biāo)準(zhǔn)誤僅為0.003,說明該預(yù)測(cè)仍有實(shí)用意義(圖9、圖10)。
圖7 訓(xùn)練集TVB-N值Fig.7 TVBN of training set data
圖8 訓(xùn)練集POV值Fig.8 Peroxide vale of training set data
圖9 測(cè)試集TVB-N值Fig.9 TVBN of test set data
圖10 測(cè)試集POV值Fig.10 Peroxide vale of test set data
PEN3電子鼻測(cè)試香腸樣品的最佳進(jìn)樣條件為:進(jìn)樣溫度35℃,富集時(shí)間30 min,頂空體積100 mL,采集時(shí)間為55~60 s。
收集香腸發(fā)酵過程中氣味指紋數(shù)據(jù),經(jīng)過PCA及LDA分析,表明PEN3電子鼻的傳感器陣列可以有效地區(qū)分不同發(fā)酵時(shí)期的香腸樣品。并推測(cè)香腸氣味指紋的預(yù)測(cè)值變化與發(fā)酵過程中TVB-N值及POV值的變化存在顯著的相關(guān)關(guān)系(R2:0.994 2和0.991 1)。
通過建立基于PLS的氣味指紋預(yù)測(cè)模型,可實(shí)現(xiàn)對(duì)影響香腸品質(zhì)的理化指標(biāo)(TVB-N值及POV值)的快速預(yù)測(cè)。為生產(chǎn)中對(duì)香腸品質(zhì)的檢測(cè)和控制提供了一種便捷、快速的新方法。
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