石嬌嬌，張建軍，鄧靜，鄧毛程，吳華昌

1(四川理工學(xué)院，四川自貢，643000) 2(廣東輕工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州，510300)

自然發(fā)酵甜面醬是面粉經(jīng)過高鹽拌曲，日曬夜露而成的傳統(tǒng)調(diào)味品，其口感濃郁，細(xì)膩可口，以獨(dú)特的酯香和醬香味而深受消費(fèi)者歡迎［1］。在甜面醬風(fēng)味形成的過程中酵母菌起到了至關(guān)重要的作用，其發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇和細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸在酯化酶的作用下反應(yīng)生成酯類，形成風(fēng)味成分的主體［2］。

生香酵母是一類能夠代謝產(chǎn)生香氣成分的酵母菌的總稱，發(fā)酵過程中除參與醛縮醇類、含硫化合物等香氣成份的生成外，還一定程度地參與氨基酸和有機(jī)酸類的生成，因此能顯著增加食品的香氣成份［3］。目前研究人員對(duì)生香酵母的應(yīng)用已做了較多嘗試，Thin Thin Wah［4］等將 Pichia guilliermondii和 Zygosaccharomyces rouxii共培養(yǎng)添加到泰國(guó)豆醬中，發(fā)酵2個(gè)月的樣品中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯含量分別提高了1.8、4.2倍，豆醬特征性香氣成分 HEMF 也提高了2.5 倍;Jie feng［5］等發(fā)現(xiàn) Candida etchellsii能夠大量產(chǎn)生酒石酸、蘋果酸等有機(jī)酸，也能夠大量合成豆醬中獨(dú)特的香味成分—愈創(chuàng)木酚(4-EG)。曾鵬［6］利用嗜殺型生香酵母成功將清酒中的總酯含量提高了50%。因此將生香酵母添加到發(fā)酵食品中對(duì)改善產(chǎn)品風(fēng)味，提高產(chǎn)品質(zhì)量，具有重大的實(shí)踐意義。然而關(guān)于甜面醬中生香酵母的研究則比較少，曾燦偉［7］確定了自然面醬中僅存在釀酒酵母且具有較強(qiáng)的產(chǎn)醇能力，重要的酯類物質(zhì)是由前期霉菌產(chǎn)生的。孟鴛［8］等證明了隨著溫度的升高，酯類物質(zhì)逐漸減少，而醛類物質(zhì)逐漸增多。因此目前對(duì)于甜面醬中生香酵母的研究較為籠統(tǒng)，對(duì)特定菌株的相關(guān)揮發(fā)性香氣成分也未見報(bào)道。

在實(shí)際發(fā)酵過程中甜面醬醬醅的溫度可達(dá)到45～50℃［9］，這將嚴(yán)重抑制生香酵母的生長(zhǎng)和代謝，所以應(yīng)用于甜面醬生產(chǎn)中的生香酵母菌必須具有一定的耐高溫性。因此篩選耐高溫生香酵母并研究其高溫下代謝產(chǎn)生的香氣成分，對(duì)甜面醬的實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本實(shí)驗(yàn)選擇已發(fā)酵7個(gè)月的甜面醬樣品篩選耐高溫生香酵母，進(jìn)行了菌種分類鑒定以及高溫發(fā)酵產(chǎn)物中的揮發(fā)性香氣成分的初步分析，明確了不同生香酵母菌株的揮發(fā)性香氣成分和相對(duì)含量，為其在甜面醬工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品和培養(yǎng)基

甜面醬:四川省自貢市某食品有限公司2012年8月樣品(發(fā)酵7個(gè)月)。

孟加拉紅培養(yǎng)基:蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，瓊脂 2%，1/3000 孟加拉紅溶液10%，補(bǔ)足蒸餾水，分裝121℃滅菌20 min。氯霉素0.01%用少量乙醇溶解，加入已滅菌的45～50℃培養(yǎng)基中，制備平板。

YPD培養(yǎng)基:酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，自然pH。

豆芽汁培養(yǎng)基:稱取100 g黃豆芽，加水1 000 mL煮沸30 min，用紗布過濾，放入20 g葡萄糖加熱溶解后，分裝121℃滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生香酵母的篩選

1.2.1.1 耐高溫酵母菌的篩選

準(zhǔn)確稱取5 g甜面醬于45 mL無菌水中，置于搖床45℃，150 r/min培養(yǎng)30 min。用移液槍準(zhǔn)確吸取1 mL上清液做十倍梯度稀釋，取不同濃度的稀釋液100 μL涂布到孟加拉紅平板培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中45℃培養(yǎng)2～3 d，挑取疑似酵母菌株的單菌落鏡檢、純化并保藏。

1.2.1.2 生香能力研究

挑取1環(huán)斜面耐高溫酵母接種至50 mLYPD培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)20 h，制成種子液。按2%的接種量，接種到豆芽汁液體培養(yǎng)基中，于45℃恒溫靜置培養(yǎng)5 d，嗅聞法確定是否產(chǎn)香［10］。

1.2.1.3 生香酵母的鑒定

參照《真菌鑒定手冊(cè)》［11］及《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》［12］對(duì)耐高溫生香酵母進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，相關(guān)生理生化實(shí)驗(yàn)包括糖發(fā)酵、碳源/氮源同化、高糖發(fā)酵、脲酶和石蕊牛奶實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)生香酵母的揮發(fā)性香氣成分

1.2.2.1 頂空固相微萃取方法條件

準(zhǔn)確量取6 mL發(fā)酵液于15 mL頂空瓶中恒溫(60 ℃)水浴，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中平衡5 min后吸附30 min(在固相微萃取裝置上實(shí)現(xiàn))，后將萃取頭移入氣相色譜的高溫汽化室中解吸5 min，進(jìn)行GC-MS分析(攪拌速度600 r/min)，測(cè)定生香酵母發(fā)酵液中的揮發(fā)性香氣成分。

1.2.2.2 定性與定量分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理由GC-MS數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)完成，未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與NSIT譜庫(kù)和RTLPEST譜庫(kù)相匹配，僅當(dāng)匹配度大于800(最大值為1 000)的鑒定結(jié)果才予以報(bào)道。采用峰面積歸一化法定量計(jì)算出各揮發(fā)性成分的含量。

1.2.2.3 GC-MS 條件

色譜條件:毛細(xì)管色譜柱Agilent HP-INNOWax(60 m ×250 μm，0.25 μm);手動(dòng)無分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250℃;程序升溫:初始溫度45℃，保留3 min，以10℃/min的速率升至200℃，保留5 min;檢測(cè)器溫度250℃;載氣He，流速1 mL/min。

質(zhì)譜條件:EI電離源，電子能量70 eV，掃描范圍10～450 u，離子源溫度230℃;接口溫度250℃。

1.2.3 篩選不同菌株主體香氣成分

根據(jù)風(fēng)味貢獻(xiàn)率理論，即香氣物質(zhì)的濃度或相對(duì)含量與香氣閾值的比值確定特征香氣的方法，從生香酵母高溫發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣成分中篩選出主體香氣。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 耐高溫生香酵母的篩選

根據(jù)酵母菌具有出芽生殖這一典型特征，按照1.2.1.1的方法從自然發(fā)酵甜面醬中篩選出15株在45℃高溫下生長(zhǎng)良好的的酵母菌株(菌株生長(zhǎng)相關(guān)數(shù)據(jù)另行發(fā)表)，進(jìn)一步做產(chǎn)香能力研究，結(jié)果如表1所示。耐高溫菌株Y1、Y4、Y5、Y7、Y9和 Y11在豆芽汁培養(yǎng)基中45℃高溫發(fā)酵5 d后能夠產(chǎn)生濃郁的香氣，Y2、Y8、Y10、Y12、Y14 和 Y15 產(chǎn)生的香氣較濃，Y6和Y13產(chǎn)生較淡的香氣，而Y3發(fā)酵產(chǎn)生的香氣最弱。

表1 耐高溫菌株產(chǎn)香能力研究Table 1 The aroma-producing capacity study of yeast strains resistant to high temperature

2.2 生香酵母的鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)

劃線培養(yǎng)已純化的耐高溫生香酵母，于28℃恒溫培養(yǎng)24 h，肉眼觀察酵母菌株的菌落形態(tài)，顯微鏡下觀察酵母的細(xì)胞形態(tài)及生成孢子的情況，結(jié)果如表2所示。

表2 生香酵母的菌落及個(gè)體形態(tài)Table 2 The colonies and individual shapes of aroma-producing yeast strains

2.2.2 生理生化鑒定

對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》及《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》對(duì)6株耐高溫生香酵母進(jìn)行生理生化鑒定試驗(yàn)，鑒定結(jié)果如表3所示。

表3 生香酵母的生理生化鑒定Table 3 The physiological and biochemical identification of aroma-producing yeast strains

依據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》及《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》和各分離菌株的形態(tài)特征、生理生化特征，初步將分離菌種Y1、Y4、Y5歸類為漢遜酵母(Hansenula)，Y7、Y9 為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Y11為紅酵母(Rhodotorula)。

2.3 高溫發(fā)酵代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性成分的分析

在豆芽汁培養(yǎng)基中高溫發(fā)酵篩選出來的6株耐高溫生香酵母，利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)發(fā)酵液中的揮發(fā)性香氣成分，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，不同生香酵母高溫發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣成分的種類和含量存在極大差異。產(chǎn)生揮發(fā)性香氣成分種類和相對(duì)含量最大的均為Y7，共檢測(cè)出7種化合物，香氣成分占總揮發(fā)性成分總量的94.05%，其中乙醇的相對(duì)含量最高，但閾值也最高(14 000 mg/L)，因此香氣值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其他香氣成分;辛酸乙酯(閾值1 mg/L)和己酸乙酯(閾值1.3 mg/L)的含量相對(duì)較高，且閾值較低，因此香氣值相對(duì)較大;醛類物質(zhì)的閾值相對(duì)較高且含量較小，因此菌株Y7高溫發(fā)酵的主體香氣成分是辛酸乙酯，其次為己酸乙酯。香氣成分占總揮發(fā)性成分比例稍稍低于Y7菌株的是Y1(89.08%)，其中己酸乙酯、乙酸-3-甲基丁酯(閾值1.5 mg/L)和辛酸乙酯的相對(duì)含量占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，香氣值最大;癸酸乙酯的閾值雖然也較低(1.5 mg/L)，但其相對(duì)含量?jī)H為0.14%，香氣值最低;2-戊基呋喃屬于雜環(huán)類物質(zhì)，閾值一般高于酯類物質(zhì)且相對(duì)含量較低，香氣值也較低，因此菌株Y1最主要的香氣成分是己酸乙酯，其次為乙酸-3-甲基丁酯。菌株Y5和Y11高溫發(fā)酵產(chǎn)生的香氣成分所占比例相當(dāng)，其中Y5產(chǎn)生的辛酸乙酯和3-羥基丁酮所占比例相對(duì)較大，但比較相對(duì)含量和閾值可知，菌株Y5和Y11最主要的香氣成分均為辛酸乙酯。菌株Y9高溫發(fā)酵除了產(chǎn)生香氣值最大的辛酸乙酯外，還能夠產(chǎn)生苯乙醇、苯甲醛和癸酸乙酯，但三者的閾值較高，且含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于辛酸乙酯，因此菌株Y9的最主要的香氣成分也是辛酸乙酯。Y4高溫發(fā)酵只檢測(cè)得到2種香氣成分，占總揮發(fā)性成分的24.31%，其中己酸乙酯是最主要的香氣成分。

隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，不同菌株發(fā)酵終產(chǎn)物組成趨于穩(wěn)定，酯類物質(zhì)成為主要的香氣成分，為甜面醬增酯添香。不同菌株能夠特異性產(chǎn)生相關(guān)香氣成分，其中乙酸-3-甲基丁酯僅在Y1發(fā)酵過程中產(chǎn)生。2-甲基丙醇和庚烯僅在Y5發(fā)酵過程中產(chǎn)生，前者為傳統(tǒng)發(fā)酵食品中重要的芳香雜醇，常通過類似魯氏接合酵母中的Ehrlich途徑產(chǎn)生，后者是一種極不穩(wěn)定的果香烯烴類，可通過氧化或還原形成較為穩(wěn)定的大分子香氣化合物。壬醛僅在菌株Y7發(fā)酵過程中產(chǎn)生，是一種重要的食品添加劑和常用香料，性質(zhì)也較為穩(wěn)定。在自然發(fā)酵甜面醬中，不同生香酵母的代謝途徑相互交錯(cuò)，產(chǎn)生更為復(fù)雜的代謝產(chǎn)物，對(duì)甜面醬的風(fēng)味形成至關(guān)重要。

表4 耐高溫生香酵母發(fā)酵代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性香氣成分的檢測(cè)Table 4 Detection of metabolism of aroma-producing yeast strains resistant to high temperature

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從自然發(fā)酵甜面醬中篩選得到了6株能夠耐受45℃且正常生長(zhǎng)的生香酵母，通過形態(tài)學(xué)和相關(guān)生理生化鑒定，初步鑒定3株為漢遜酵母，2株為釀酒酵母，1株為膠紅酵母。利用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)了生香酵母高溫發(fā)酵代謝產(chǎn)物的差異，確定了不同菌株高溫下的主體香氣情況，其中Y1和Y4最主要的香氣成分為己酸乙酯，而其余菌株最主要的香氣成分均為辛酸乙酯，從而為菌株在甜面醬中的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。然而除了已知的生香作用外，生香酵母在不同發(fā)酵食品中還有很多其他的功能。

漢遜酵母除了能夠促進(jìn)豆醬特征香氣成分(如4-愈創(chuàng)木酚、乙酸乙酯、HEMF)的形成，其自身也能夠合成異丙醇、異戊醇等高級(jí)醇，糠醛、苯甲醛等醛類，從而影響豆醬中的香氣平衡，目前在韓國(guó)大醬［13］、醬醪［14］、中國(guó)黃豆醬［15］中都已分離得到。漢遜酵母常和乳酸菌共培養(yǎng)作為發(fā)酵劑在干酪［16］、香腸［17］等發(fā)酵過程中已有應(yīng)用，可以顯著提高發(fā)酵食品的風(fēng)味，同時(shí)縮短生產(chǎn)周期。在酒類釀造和工業(yè)酒精生產(chǎn)中，釀酒酵母發(fā)揮了舉足輕重的作用。近年來對(duì)釀酒酵母生產(chǎn)油脂、為醬類食品增酯增香能力的研究也大大提高了其應(yīng)用價(jià)值。高玉榮［18］等在豆醬快速釀造工藝后發(fā)酵期添加釀酒酵母，縮短了后發(fā)酵時(shí)間并促進(jìn)乙醇等風(fēng)味物質(zhì)的形成，使成品在較短的時(shí)間內(nèi)形成醬品所特有的醇香及酯香。紅酵母能產(chǎn)生丙氨酸、谷氨酸、蛋氨酸等多種氨基酸［19］，這些氨基酸構(gòu)成發(fā)酵食品的主要鮮味成分;能發(fā)酵產(chǎn)胡蘿卜素［20］，使發(fā)酵食品具有安全誘人的色澤。但有關(guān)紅酵母應(yīng)用到食品中產(chǎn)香的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中紅酵母高溫發(fā)酵產(chǎn)生辛酸乙酯等閾值極低的揮發(fā)性香氣成分，己酸乙酯、3-羥基-2-丁酮和2-戊基呋喃等常見的香氣成分，在甜面醬高溫醬醅發(fā)酵中具有極大的應(yīng)用前景。

［1］ 宋安東.調(diào)味品發(fā)酵工藝學(xué)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2009:220-222.

［2］ 曾燦偉，金華勇，李冬生，等.自然與人工氣候條件下釀造甜面醬過程中的菌相分析［J］.中國(guó)調(diào)味品，2009，34(4):101-105.

［3］ 蒲春，胡沂淮，賈亞偉.產(chǎn)酯酵母的篩選及其發(fā)酵特性研究［J］.釀酒科技，2013，10(3):47-49+53.

［4］ Thin Thin Wah，Supawan Walaisri，Apinya Assavanig，et al.Co-culturing of Pichia guilliermondii enhanced volatile flavor compound formation by Zygosaccharomyces rouxii in the model system of Thai soy sauce fermentation［J］.International Journal of Food Microbiology，2013，160(3):282-289.

［5］ FENG Jie，ZHAN Xiao-bei，WANG Dong，et al.Identification and analysis of the metabolic functions of a high-salttolerant halophilic aromatic yeast Candida etchellsii for soy sauce production［J］.Microbiol Biotechnol，2012，28(4):1 451-1 458.

［6］ 曾鵬.應(yīng)用嗜殺生香酵母提高清酒質(zhì)量的研究［J］.釀酒科技，1992，21(3):12-13.

［7］ 曾燦偉.甜面醬釀制過程中的菌相分析及風(fēng)味成分研究［D］.武漢:湖北工業(yè)大學(xué)，2009:52-56.

［8］ 孟鴛，喬宇，劉彩香，等.前期發(fā)酵溫度對(duì)甜面醬揮發(fā)性成分的形成及品質(zhì)的影響［J］.食品科學(xué)，2010，31(23):248-252.

［9］ 金華勇.甜面醬發(fā)酵工藝試驗(yàn)研究［D］.武漢:湖北工業(yè)大學(xué)，2009:9-14.

［10］ 王國(guó)良，宋俊梅，曲靜然.生香酵母及其應(yīng)用［J］.食品工業(yè)，2004，11(3):16-17.

［11］ 魏景超.真菌鑒定手冊(cè)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979:102-117.

［12］ 巴尼特A，佩恩RW，亞羅D.酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)［M］.胡瑞卿譯.青島:青島海洋出版社，1991:20-28+425.

［13］ Tae-Woon Kim，Jun-Hwa Lee，Sung-Eon Kim，et al.Analysis of microbial communities in doenjang，a Korean fermented soybean paste，using nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，131(2):265-271.

［14］ Lee T S，Lee S K，Shin B K，et al.Studies on the yeasts for the brewing of soy sauce(2)［J］.Journal of the Korean Agricultural Chemical Society，1970，102(13):171-180.

［15］ 黃永.黑龍江地區(qū)自然發(fā)酵黃豆醬中酵母菌的分離鑒定及篩選［D］.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006:38-46.

［16］ 王永麗，李曉東，姚春燕，等.乳酸乳球菌與酵母菌混合培養(yǎng)時(shí)菌間的相互影響［J］.中國(guó)乳品工業(yè)，2012，40(12):8-11.

［17］ 蔣云升，汪志君，于海，等.如式香腸用發(fā)酵劑多菌種混培養(yǎng)技術(shù)的研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(8):410-413.

［18］ 高玉榮.豆醬快速釀造工藝研究［J］.糧食與食品工業(yè)，2004，11(4):33-36.

［19］ 邢旭，薛飛燕，譚天偉，等.粘紅酵母在味精廢水中發(fā)酵生產(chǎn)油脂［J］.生物加工過程，2010，8(1):6-10.

［20］ 劉琦，辛嘉英.紅酵母及紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2012，31(3):381-384.