張淑靜，劉力源，殷宗俊，丁月云，王菊花，周杰

(安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽 合肥，230036)

研究控制肉質(zhì)相關性狀的遺傳基礎表明［1-3］，在雞的第1號染色體94cM處、牛的第5號染色體119.7cM處以及1～1.78(cM)處存在與肉多汁性、剪切力、大理石花紋等相關的數(shù)量性狀位點(QTLs)。因此，根據(jù) Animal QTLdb［4］提供的這些 QTLs信息，在豬的基因組中比對出了相應的染色體位置。其中，腺苷酸琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase，ADSL)以及甘氨酰胺核苷酸合成酶(glycinamide ribonucleotide synthetase，GARS)、5-氨基咪唑核苷酸合成酶(aminoimidazole ribonucleotide synthetase，AIRS)和甘氨酰胺核苷酸轉(zhuǎn)甲基酶(glycinamide ribonucleotide transformylase，GART)基因分別位于豬第5號染色體7.19～7.23(cM)和第13號染色體119.4～119.5(cM)處。而文獻表明［5］，ADSL 和 GARS-AIRSGART是肌苷酸(inosine monophosphate，IMP)合成相關的2個關鍵酶基因。

長期以來，研究豬的重點主要集中在提高生長速度和增加瘦肉率方面，在肉品質(zhì)改善和提高以及肉質(zhì)性狀遺傳基礎等方面缺少關注，這樣導致了商品豬豬肉口感下降嚴重［6-7］。許多學者認為豬肉的香味和適口性可能與肉中的肌內(nèi)脂肪、肌苷酸、游離脂肪酸組分等呈味物質(zhì)有關［8-10］。其中IMP鮮味最強，是肉質(zhì)鮮味的重要成分［5］。IMP在北京油雞中的遺傳力為0.23，屬中等遺傳力［11］，目前國際上已把 IMP含量作為一個影響雞肉風味的重要指標。然而國內(nèi)外有關豬IMP含量以及與IMP相關基因的研究較少，且結果不一［12-16］。本實驗選取背最長肌IMP含量為肉質(zhì)性狀指標，研究影響IMP含量的基因ADSL與GARS-AIRS-GART在2種安徽地方豬種圩豬、六白豬以及外來豬種長白豬肝臟、心臟、背最長肌組織中的表達，以檢測這些基因在肝臟、心臟中轉(zhuǎn)錄水平以及在背最長肌組織中轉(zhuǎn)錄水平與IMP含量的關系。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及樣品采集

各試驗用豬分別從安徽省安泰農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司圩豬保種場選取待宰商品豬圩豬21頭，望江縣現(xiàn)代良種養(yǎng)殖有限公司選取六白豬13頭，安徽長風農(nóng)牧科技有限公司選取長白豬6頭，常規(guī)飼養(yǎng)管理。(出欄日期地方豬10個月 ，長白豬6個月)屠宰前禁食12 h，正常飲水。屠宰前禁喂24 h稱重，按“瘦肉型豬胴體性狀測定技術規(guī)范(NY/T825-2004)”方法屠宰，屠宰時取腰椎處背最長肌，測定肌苷酸含量，分別取圩豬，六白豬，長白豬的心臟、肝臟、背最長肌新鮮組織100 mg，液氮冷凍，后轉(zhuǎn)移至 -80℃ 冰箱保存。

1.2 主要儀器、試劑

儀器:高速冷凍離心機(Sigma，德國)，PCR儀(伯樂，美國)，紫外分光光度計(島津，日本)，Rotorgene 6000熒光定量 PCR儀(Corbett，澳大利亞)，SMA1000超微量紫外分光光度計(Merinton，中國)，高效液相色譜儀Aiglent1100、ZORBAX色譜柱SB-C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm)、自動進樣器 G1313A(100 μL)、四元泵 G1311A(Agilent，美國)，圓周振蕩器 MS3基本型(IKA，德國)，離心機 Eppendor FAG22331(Hamburg，德國)，超純水器原子Ⅱ型(成都康林科技有限公司)，組織勻漿機AM-6(經(jīng)濟制作所，日本)，超聲波清洗機KQ-300DE(昆山市超聲儀器有限公司)，pH測定儀HI-9025(Hanna，意大利)。

試劑:Trizol Reagent、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix TaqTMVersion 2.0、SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ(大連寶生物)，肌苷酸標準品(HPLC級，Sigma，美國)，高氯酸(GR，含量70% ～72%)上海金鹿化工技術有限公司，甲醇、乙腈(Fisher，美國)。

1.3 肌苷酸含量測定［17］

肌苷酸:高效液相色譜法測定肌肉中肌苷酸的含量，色譜柱:3.9 mm ×30 cm，C18柱。

1.3.1 樣品前處理

于屠宰后1.5 h內(nèi)迅速采集背最長肌，當冷藏時間達到24 h時，取出肉樣制備肌苷酸測定樣，使用絞肉機絞碎肌肉樣品，稱取5g，準確至0.000 1 g，置于50 mL塑料離心管中，分次加入共20 mL 6%HClO4，用高速組織勻漿機勻漿。勻漿液以8 000 r/min離心13 min，過濾于100 mL三角瓶中。將沉淀物用15 mL 6%HClO4再次勻漿、離心，合并2次上清液，用5.0 mol/L和0.5 mol/L NaOH調(diào) pH值至6.5，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容搖勻。測定前用0.45 μm濾膜過濾后用于HPLC分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱:Agilent 1 100 d C18柱(5 μm，Φ4.6 mm ×150 mm);流動相:50 mmol/L pH 6.5甲酸銨緩沖溶液(含5%甲醇);流速:1 mL/min;柱溫:25℃;進樣量:5μl;紫外檢測波長:254 nm;運行時間:標準工作液運行4 min，樣品提取液運行11 min。

1.4 組織RNA提取及反轉(zhuǎn)錄［18］

分別取圩豬，六白豬，長白豬的心臟、肝臟、背最長肌新鮮組織100 mg，液氮冷凍，按Trizol Reagent試劑盒使用說明提取各組織總RNA。測定RNA的濃度和純度，甲醛變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。RNA樣品于-80℃ 冰箱中保存。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

按Trizol Reagent試劑盒要求提總RNA。紫外分光光度計測定OD260/OD280值在1.8～2.0為合格，根據(jù)OD260值計算RNA的產(chǎn)量。甲醛變性凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量;用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對RNA進行反轉(zhuǎn)錄。

1.5 背最長肌中ADSL和GARS-AIRS-GART基因表達量的Q-PCR檢測

根據(jù)Genbank中豬 ADSL、GARS-AIRS-GART和內(nèi)標β-Actin cDNA序列，利用Primer 5.0軟件設計引物序列，由上海生工生物公司合成引物。引物序列和PCR參數(shù)見表1。

表1 用于Real-time quantitative PCR的引物序列及PCR參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameter used for real-time quantitative PCR

普通PCR檢測cDNA純度，相關參數(shù):95℃預變性5 min，95 ℃變性 30 s、58 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸30 s、30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取產(chǎn)物5 μL在1%的瓊脂凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果。熒光實時定量 PCR擴增，反應體系 25 μL:SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O(高壓)8.5 μL。95℃預變性5 min，95℃變性10 s、57.4℃退火20 s、72℃延伸15 s，45個循環(huán)。于72℃ 15 s時收集熒光值，從而得出每一個循環(huán)結束后cDNA擴增后的量。

2 統(tǒng)計分析

用 2-ΔΔCT法對有效性數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析［20］。目的基因的相對表達量為 2-ΔΔCT，ΔΔCT =(CT.Target gene-CT.β-actin)x-(CT.Target gene-CT.β-actin)control。數(shù)據(jù)用平均值±標準誤(M±SE)表示，使用SPSS16.0軟件對結果中的數(shù)據(jù)進行分析，均值差異顯著性采用One-Way ANOVA統(tǒng)計。顯著性差異水平為P＜0.05，極顯著性差異水平為 P＜0.01。采用Bivariate correlation分析進行相關性分析。

3 結果分析

3.1 圩豬，六白豬，長白豬肌肉中肌苷酸含量比較

長白豬背最長肌中肌苷酸極顯著高于六白豬與圩豬(P＜0.01)，而圩豬肌肉中肌苷酸和六白豬肌肉中肌苷酸含量無顯著差異(圖1)。

圖1 不同品種豬肌苷酸含量差異Fig.1 Comparison of IMP content between different breeds of pigs

3.2 圩豬，六白豬和長白豬肝臟，心臟和背最長肌組織中ADSL mRNA表達情況

3個豬種ADSL基因在相同組織的表達模式不盡相同，圩豬肝臟組織中ADSL mRNA表達量分別顯著和極顯著高于六白豬(P＜0.05)和長白豬(P＜0.01);圩豬和長白豬心臟ADSLmRNA表達量顯著高于六白豬(P＜0.05);圩豬背最長肌組織ADSL mRNA表達量顯著高于六白豬(P＜0.05)，而六白豬與長白豬無顯著差異。不同組織ADSL基因表達模式在3個豬種基本相同，均表現(xiàn)為背最長肌中最高，心臟次之，肝臟最低的趨勢。其中在圩豬背最長肌的表達量顯著高于肝臟(P＜0.05)(表2)。

3.3 圩豬，六白豬和長白豬心臟，背最長肌和肝臟組織中GARS-AIRS-GART mRNA表達情況

3個豬種GARS-AIRS-GART基因在相同組織的表達模式不盡相同，除長白豬在背最長肌組織中顯著高于六白豬(P＜0.05)外，其他均無明顯差異。GARS-AIRS-GART基因在3種豬的肝臟，心臟，背最長肌的表達模式基本相同，即均表現(xiàn)為背最長肌最高，肝臟次之，心臟最低的趨勢(表3)。

表2 圩豬，六白豬和長白豬肝臟，心臟和背最長肌組織中ADSL mRNA的表達情況Table 2 Expression levels of ADSL mRNA of liver，heart and longissimus dorsi muscle in Wei Pig，Liubai pig and Landraces

表3 圩豬，六白豬和長白豬心臟，背最長肌和肝臟組織中GARS-AIRS-GART mRNA的表達Table 3 Expression levels of GARS-AIRS-GART mRNA of liver，heart and longissimus dorsi muscle in Wei pig，Liubai pig and Landraces

3.4 基因表達量與IMP含量的相關性分析

ADSL基因在長白豬肝臟的表達量與長白豬背最長肌的IMP含量顯著負相關(P＜0.05)。GARSAIRS-GART基因在圩豬肝臟和六白豬心臟的表達量分別與圩豬背最長肌和六白豬背最長肌的IMP含量呈極顯著負相關(P＜0.01)(表4)。

4 討論

肌苷酸是影響肌肉鮮味的主要成分之一，屠宰后動物機體正常的生理代謝功能遭到破壞，細胞內(nèi)糖原有氧代謝轉(zhuǎn)化為無氧酵解，生成乳酸使pH值下降，同時肌肉中ATP減少使肌質(zhì)網(wǎng)功能失常，ATP酶活化，剩余ATP在ATP酶的作用下分解生成ADP，ADP在多種酶的作用下生成肌苷酸，并進一步水解生成次黃嘌呤和核糖。肌肉中次黃嘌呤核苷酸及其他分解產(chǎn)物的積累可增加肉的鮮味［16］。呼紅梅等的研究表明肉質(zhì)優(yōu)良的地方品種豬肌肉IMP含量高于外來瘦肉型品種及雜交豬［16］。而劉家忠等報道梅山豬與杜洛克豬肌肉IMP含量無顯著差異［12］;陶勇等報道地方品種豬與外來品種及雜交豬肌肉IMP含量沒有明顯差異［13］;郭建鳳報道長白豬、大約克及杜洛克豬肌肉IMP含量差異不顯著［15］;張克英等發(fā)現(xiàn)榮昌豬與長白豬IMP無品種差異，但均高于大約克豬［14］。本實驗中發(fā)現(xiàn)長白豬背最長肌肌肉中肌苷酸顯著高于六白豬與圩豬。由于肌苷酸的含量受動物的品種、飼料、飼養(yǎng)環(huán)境、屠宰時間、肌肉酸堿度、屠宰后處理等因素的影響［21-24］，具體原因還有待進一步研究。

表4 ADSL和GARS-AIRS-GART基因表達量與IMP含量的相關性分析Table 4 Correlation analysis between the expression level of ADSL and GARS-AIRS-GART gene and the IMP content

IMP在體內(nèi)的合成代謝過程十分復雜，涉及10種關鍵酶，由ADSL基因所編碼的腺苷酸琥珀酸裂解酶是嘌呤核苷酸合成過程中的關鍵酶之一。ADSL主要催化AMP生化合成的2個反應:(1)由SAC IAR生成AICAR的反應;(2)由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸單磷酸的反應［25］。而 GARS、GART和 AIRS分別催化次黃嘌呤核苷酸合成的第二、三和五步反應，從而加速次黃嘌呤和黃嘌呤的分解，而肌肉中次黃嘌呤核苷酸及其他分解產(chǎn)物的積累可增加肉的鮮味［26，27］。Ye等對北京油雞的研究結果得出以下結論，ADSL和GARS-AIRS-GART基因可能是影響肌肉中IMP含量的主效基因或與主效基因密切相關，由于IMP是最重要的風味物質(zhì)之一，在ADSL和GARSAIRS-GART 2個基因中發(fā)現(xiàn)的標記以及相關基因型都可以看作提高雞肉肉質(zhì)的潛在分子標記［10］。Shu等運用PCR-SSCP技術對雞GARS-AIRS-GART基因和肌肉IMP含量之間的關系進行研究，發(fā)現(xiàn)某些位點的突變對肌肉IMP的含量有一定的影響［21］。

現(xiàn)有的研究多集中于對禽類ADSL和GARSAIRS-GART基因多態(tài)性與IMP含量相關性的研究，對于豬ADSL和GARS-AIRS-GART基因組織表達量的研究很少，僅見劉基偉報道的成年通城豬 ADSL mRNA表達水平由高到低依次為背最長肌，腎臟，肝臟和心臟［28］。在本實驗中，ADSL基因在3種豬表達模式基本相同，均表現(xiàn)出背最長肌中最高，心臟次之，肝臟表達量最低的趨勢。Tian等對草魚的研究表明，ADSL基因在肌肉組織中表達量最高，剩下的依次為心臟、腦、肝臟、腸、腎臟和鰓［29］。劉長青等發(fā)現(xiàn)壽光雞ADSL表達最多的是胸肌，其次是肝臟、脾、腎和腿肌，在心、肺和腦中表達量較低［30］，這些結果均表明肌肉中ADSL基因的表達量最高，與本實驗的結果一致。目前尚未見GARS-AIRS-GART基因在組織中表達量的研究報道，本研究發(fā)現(xiàn)GARS-AIRS-GART基因在背最長肌中的表達量最高，肝臟次之，心臟較低，3種豬的表達模式基本相同。

徐善金等發(fā)現(xiàn)，鴨ADSL基因的CDS序列與雞的同源性極高，在肌肉組織中的表達量與對應 IMP含量表現(xiàn)為不同品種、同一品種不同性別、同一性別不同部位間極顯著或顯著差異，相關性分析表明，ADSL基因表達量與IMP含量呈對數(shù)函數(shù)關系，兩者顯現(xiàn)出顯著正相關［31］。

而本實驗結果表明，長白豬的背最長肌肌苷酸含量高于圩豬和六白豬。ADSL和GARS-AIRS-GART mRNA表達量均表現(xiàn)為在背最長肌中高于心臟和肝臟的趨勢。此外，相關性分析表明，ADSL基因和GARS-AIRS-GART基因表達量與IMP含量負相關，與在禽類的結果不同，這可能與畜禽的種屬差異有關，其具體的作用機制還有待進一步研究。

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