李聽聽，陳偉，李廣富，盧中一，劉錦繡

(山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東泰安，271018)

我國是儲糧大國，玉米是我國三大主要糧食品種之一，產(chǎn)量約為全國糧食總產(chǎn)量的1/4［1］。玉米屬于不耐儲品種，在儲藏期間會受到各種微生物特別是霉菌的危害，霉菌感染糧谷作物，能引起食物發(fā)生腐敗變質(zhì)，尤其在高濕高溫的環(huán)境下，霉菌生長旺盛，同時其分泌的毒素對人體有很強的致癌作用，因此，防止真菌污染和真菌毒素是糧食儲藏過程中最關(guān)鍵的問題［2-3］。

在各類霉菌產(chǎn)生的毒素中，黃曲霉毒素B1最為常見，且毒性最大［4］。高效液相色譜法測定黃曲霉毒素B1是目前國內(nèi)使用最多、最為權(quán)威的方法，具有高效、準確性好、靈敏度高、檢測限低等特點［5］。

早在20世紀50年代，Lichtwardt等對儲糧真菌進行了調(diào)查和分類，得出危害玉米的主要微生物是霉菌，發(fā)現(xiàn)灰綠曲霉和白曲霉是引起儲糧劣變主要真菌;隨后，Pitt和Magan等對儲糧真菌生長及產(chǎn)毒所需最低水分活度做了研究［6-7］，表明小麥水分含量在13.0%以下，就可以阻止大部分微生物的生長;Ayerst等研究了主要儲糧真菌的生長條件［8］，得出多數(shù)霉菌生長的最適溫度是25～30℃，繁殖所需最低含水量一般為13%～18%。

本實驗設(shè)定不同的相對濕度和水分含量，對儲藏玉米中的霉菌和黃曲霉毒素B1進行測定，并分析糧食儲藏過程中黃曲霉毒素B1與霉菌的關(guān)系，探討不同相對濕度儲藏環(huán)境下，優(yōu)勢真霉菌活動差異性、黃曲霉毒素B1產(chǎn)量差異性及相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 玉米原料

岱玉D4收獲于2013年10月份，購買于泰安市農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 設(shè)備與儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，杭州瑞析科技技術(shù)有限公司;Agilent 1260熒光檢測器，杭州瑞析科技技術(shù)有限公司;BIBBY RE200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，寧波金晟杰機電有限公司;IKA渦旋振蕩器，常州冠軍儀器制造有限公司;N-EVAPTM112氮吹儀，美國Organomation Associates公司;JFSD-70實驗室粉碎磨，上海市嘉定糧儀器廠;微型高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.1.3 主要試劑

黃曲霉毒素B1標準溶液:美國02si;乙腈(色譜純):天津市凱通化學有限;甲醇、正己烷及氯仿(分析純):天津市凱通化學有限;三氟乙酸(分析純):宏欣精細化工;氯霉素:Solarbio。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米的水分調(diào)節(jié)［9］

將水分調(diào)節(jié)至 12.41%、14.30%、15.89%、17.62%、19.88% 五個梯度。將清理的玉米分5等份，每份約5 kg，置于塑料容器中，采用噴霧方法，加入不同量的無菌水，按其含水量計算調(diào)節(jié)至目標含水量所需的理論添加無菌水量，用噴霧器分3次將理論添加無菌水量的蒸餾水噴到糧食表面，邊噴邊攪拌，以保證著水的均勻。著水后的玉米放置塑料袋內(nèi)，排出袋中空氣，密封于冰箱4℃冷藏保存，平衡24 h。

1.2.2 模擬儲藏

干燥器(180 mm)內(nèi)放置不同飽和鹽溶液，以形成不同相對濕度的密閉環(huán)境件。分別以NaCl、KNO3和KCl的飽和鹽溶液配置在30℃形成75%、84%、92%不同的相對濕度。將稱取的玉米樣品500 g分別放在無菌透氣保鮮袋內(nèi)，將保鮮袋放在裝有不同飽和鹽溶液的干燥器內(nèi)，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 水分的測定

玉米樣品含水率的測定按照(GB5497-1985糧食、油料檢驗水分測定法)［10］執(zhí)行。

1.2.4 玉米霉菌菌落計數(shù)及分離與鑒定

參照國標食品衛(wèi)生微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)(GB 4789.15-2010)［11］。玉米中霉菌的分離及鑒定參照(GB/T 4789.16)［12］、中國真菌志第五卷“曲霉屬及相關(guān)有性型”和(齊祖同，1997)執(zhí)行［13］。

1.2.5 玉米黃曲霉毒素B1的提取和凈化

本實驗參照謝剛［14］等人的方法并加以改進。將儲藏35 d玉米樣品粉碎后取5 g于150 mL的錐形瓶中分別加入25 mL的甲醇水(55∶45)，用保鮮膜封口，放在超聲波清洗器中超聲20 min后取出，將溶液全部倒入離心管中，離心5 min(轉(zhuǎn)速為3 500 r/min)。離心結(jié)束后，取上層清液4 mL于另一離心管中，加入4 mL CHCl3，渦旋后靜置分層，然后用移液槍吸取下層液體于試管中，再加4 mL CHCl3重復(fù)上述操作，合并CHCl38 mL，60℃水浴氮吹干，注意避免液體鼓泡、飛濺。

1.2.6 玉米黃曲霉毒素B1的衍生

向剩余物中加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，塞上塞子，放在40℃的水浴鍋中衍生20 min，60℃水浴氮吹干，用15%的乙腈定容至1 mL，置于注射器中，用0.22 μm的濾膜過濾于進樣瓶中，供測定用［4］。

1.2.7 標準工作液的衍生

吸取黃曲霉毒素標準溶液200 μL，在60℃水浴下氮氣吹干，衍生化方法同1.2.6。

1.2.8 液相色譜條件

色譜柱:Diamonsil C18(2)(250 mm×4.6 mm i.d，5 μm 粒度)。流動相∶乙腈∶水(15∶85);流速:1 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:30℃。熒光檢測器:激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm。注:宜在色譜柱前加保護柱(或預(yù)柱)，以延長色譜柱使用壽命。

1.2.9 黃曲霉毒素B1的換算公式

y=(0.402 9x-0.564 7)×25/4/5

式中:y，每kg玉米中所含黃曲霉毒素B1的量，μg/kg;x，峰面積;25，制備的毒素提取液的總量是25 mL;4，從25 mL中取了4 mL進行檢測;5，樣品中玉米的質(zhì)量(5 g)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)處理和分析采用SAS v9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲藏期間玉米水分變化

在溫度30℃，相對濕度75%的環(huán)境中(如圖1)，玉米前14 d儲藏過程中，5個水分梯度呈現(xiàn)上升趨勢。可能是由于在低的相對濕度環(huán)境下，玉米解吸率大于回收率。隨著儲藏時間延長，玉米微生物開始大量繁殖，尤其是霉菌，大量分解著玉米中的淀粉等有機質(zhì)產(chǎn)生大量水分，通過濕熱交換，玉米中的水分大量揮發(fā)，因此余下21 d的儲藏時間內(nèi)，小麥水分會呈現(xiàn)微下降趨勢［15］。

圖1 RH 75%的環(huán)境中玉米水分含量的變化Fig.1 The corn moisture changes under relative humidity 75%environment

在溫度30℃，相對濕度84%和92%的環(huán)境(如圖2、圖3)，玉米在整個35 d的儲藏時間，兩個環(huán)境下含水量不同的玉米整體呈現(xiàn)上升趨勢，且環(huán)境濕度較高的RH 92%的玉米水分上升趨勢較明顯。這是因為中、高濕度環(huán)境下的基質(zhì)食的解吸率小于回收率，直至基質(zhì)含量與環(huán)境濕度相平衡為止［16］。經(jīng)單因素方差分析，低、中、高三個環(huán)境下不同含水量的玉米，在儲藏35 d的過程中，水分含量無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 RH 84%的環(huán)境中玉米水分含量的變化Fig.2 The corn moisture changes under relative humidity 84%environment

圖3 RH 92%的環(huán)境中玉米水分含量的變化Fig.3 The corn moisture changes under relative humidity 92%environment

2.2 黃曲霉毒素B1標準曲線方程

黃曲霉毒素B1濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性回歸方程y=0.402 9x-0.564 7，相關(guān)系數(shù)0.999 5。其中，y:濃度(mg/mL);x:峰面積。

2.3 不同儲藏環(huán)境下霉菌、木霉、黑曲霉、黃曲霉與黃曲霉毒素B1的量間關(guān)系

從表1可以看出在溫度30℃，相對濕度75%的環(huán)境中霉菌和木霉的總量隨玉米中水分含量的增加而呈現(xiàn)上升趨勢，而此環(huán)境中黑曲霉、黃曲霉的量及黃曲霉毒素B1積累量隨水分增加均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，兩種菌均在初始含水量為15.89%處取得最大菌落數(shù)，且黃曲霉毒素B1在水分含量處有最大毒素積累量，是初始毒素量的29.88倍。當玉米中的水分含量超出15.89%，通過營養(yǎng)競爭，整個儲藏過程中木霉成為第一優(yōu)勢菌，使得黃曲霉的數(shù)量大量銳減，從菌源就抑制了AFTB1量。在相對濕度75%的環(huán)境下，玉米的黃曲霉毒素的B1量隨黃曲霉的增多而增多，且最佳的產(chǎn)毒基質(zhì)為初始含水量15.89%。

在溫度30℃相對濕度84%的環(huán)境不同含水量的玉米經(jīng)過35 d的儲藏后(如表2)，隨著玉米初始含水量增加，玉米的霉菌總量、黑曲霉、木霉、黃曲霉總量及黃曲霉毒素B1的積累量均有相同的變化趨勢，都在初始含水量14.30%取得最大值，且AFTB1的量是初始值的11.25倍。當玉米含水量大于14.30%時，雖然黃曲霉數(shù)量隨水分含量增加，但木霉量增加幅度更大，而AFTB1確呈減少趨勢，這可能因為木霉不僅通過營養(yǎng)競爭抑制黃曲霉數(shù)量，還能夠降解或吸附 AFB1［17］。

表1 RH 75%水分含量霉菌、木霉、黑曲霉、黃曲霉與AFTB1的量Table 1 The number of mould，Trichoderma viride，Aspergillus niger，Aspergillus flavus and the amount of aflatoxin B1 under the relative humidity 75%environment

表2 RH 84%水分含量霉菌、木霉、黑曲霉、黃曲霉與AFTB1的量Table 2 The number of mould，Trichoderma viride，Aspergillus niger，Aspergillus flavus and the amount of aflatoxin B1 under the relative humidity 84%environment

在相對濕度92%，溫度30℃的環(huán)境中(如表3)，經(jīng)過35 d的儲藏五組不同水分含量的玉米霉變比較嚴重，說明高濕環(huán)境更適合霉菌的生長，并且初始水分含量較大的17.62%、19.88%的兩組玉米中黃曲霉的量明顯高于初始含水量為15.89%的玉米，但是黃曲霉毒素B1的量卻遠遠小于初始含水量為15.89%的玉米。這可能因為，黑曲霉［18-19］和木霉［20］均能通過細胞壁吸附、產(chǎn)生某種降解AFTB1的物質(zhì)和營養(yǎng)競爭作用等多種方式抑制了黃曲霉生長、產(chǎn)毒及增強了玉米上毒素的降解能力;也有可能，此環(huán)境條件不適合黃曲霉產(chǎn)毒。再者也進一步說明了，并不是黃曲霉的數(shù)量越多，產(chǎn)生毒素的量就越多，黃曲霉產(chǎn)毒是多種因素共同作用的結(jié)果。經(jīng)單因素方差分析，各環(huán)境條件下不同含水量玉米，儲藏35 d后，微生物各指標與黃曲霉毒素B1均有顯著性差異(P ＜0.05)。

表3 RH 92%水分含量霉菌、木霉、黑曲霉、黃曲霉與AFTB1的量Table 3 The number of mould，Trichoderma viride，Aspergillus niger，Aspergillus flavus and the amount of aflatoxin B1 under the relative humidity 92%environmen

2.4 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析表明，經(jīng)溫度30℃，相對濕度75%環(huán)境儲藏35 d的玉米，玉米上黃曲霉和黑曲霉總數(shù)均與黃曲霉毒素B1呈極顯著正相關(guān)性(P＜0.001，k≥0.997);霉菌總數(shù)和木霉總數(shù)與黃曲霉毒素B1呈負相關(guān)性。在溫度30℃相對濕度84%環(huán)境下儲藏35 d的玉米，其黑曲霉總數(shù)與黃曲霉毒素B1呈顯著正相關(guān)性(P＜0.05，k=0.921);霉菌總數(shù)、黃曲霉總數(shù)和木霉總數(shù)均與黃曲霉毒素B1呈正相關(guān)性，而玉米上的水分含量與黃曲霉毒素B1積累量呈明顯負相關(guān)性。經(jīng)溫度30℃相對濕度92%環(huán)境下儲藏35 d后的玉米，其上黃曲霉總數(shù)和水分含量與黃曲霉毒素B1的積累量呈負相關(guān)性;霉菌總數(shù)、木霉總數(shù)和黑曲霉總數(shù)與黃曲霉毒素呈正相關(guān)性。

綜上3個不同的儲藏環(huán)境相關(guān)性的分析，在中、高濕度的環(huán)境，玉米上的黃曲霉毒素B1與黃曲霉間的相關(guān)性越來越不明顯，即受其他霉菌的影響越來越顯著。

3 結(jié)論

(1)不同儲藏環(huán)境下，玉米中霉菌的生長受環(huán)境濕度和玉米本身水分含量的雙重影響，隨著環(huán)境濕度和水分含量的增加，霉菌的數(shù)量也增加，但玉米本身水分含量對霉菌生長影響更顯著;玉米含水量變化不僅與玉米儲藏環(huán)境有關(guān)，還與微生物的量有一定的關(guān)系，玉米含水量最終表現(xiàn)形式是環(huán)境因素和生物因素綜合作用的結(jié)果。

表4 AFTB1與黃曲霉、木霉、黑曲霉、霉菌及水分間相關(guān)性Table 4 The correlation among the aspergillusflavus、trichodermaviride、aspergillus Niger、mould、moisture andaflatoxin B1

(2)溫度30℃，相對濕度75%、84%、92%的條件下，玉米中最適黃曲霉的產(chǎn)毒的初始含水量分別是15.89%、14.30%、15.89%;整個儲藏過程中，木霉和黑曲霉都是優(yōu)勢菌，通過協(xié)同抑制黃曲霉的生長并降解了部分黃曲霉毒素B1。

(3)相關(guān)性分析表明，在溫度30℃，相對濕度75%環(huán)境下，玉米上黃曲霉和黑曲霉總數(shù)均與黃曲霉毒素B1呈極顯著正相關(guān)性(P＜0.001，k≥0.997)，玉米上的木霉總數(shù)和霉菌總數(shù)與黃曲霉毒素B1量呈負相關(guān);在溫度30℃相對濕度84%環(huán)境下，玉米上黑曲霉總數(shù)與黃曲霉毒素B1呈顯著正相關(guān)性(P＜0.05，k=0.921);在溫度30℃，相對濕度92%環(huán)境下，玉米上黃曲霉數(shù)量和水分含量與AFTB1呈負相關(guān)性;在中、高濕度的環(huán)境，玉米上的黃曲霉毒素B1與黃曲霉間的相關(guān)性越來越不明顯，即受其他霉菌的影響越來越顯著。

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