常海軍，周文斌，朱建飛，唐春紅

(重慶工商大學環(huán)境與生物工程學院，重慶高校催化理論與應用技術市級重點實驗室，重慶，400067)

肉的腌制處理，包括酸腌漬處理是肉常見的一種腌制嫩化方法［1］。肉的酸漬腌制過程可通過將肉浸泡在乳酸、醋酸和果汁酸等一些酸液中進行［2］。研究認為，酸腌制對肉的嫩化可能是由于肌原纖維的膨脹對肌肉結構的弱化［3］以及酸漬過程對肌束膜等結締組織膠原蛋白的直接弱化所致［4］。

膠原蛋白是構成肌內結締組織的主要結構蛋白，是一種具有一定韌性和剪切性的纖維狀蛋白［5］。肌肉的韌性在一定程度上與肌肉內膠原蛋白的含量成正比，肌內結締組織膠原蛋白被認為是影響肉嫩度的第二種主要蛋白成分［6］。研究發(fā)現(xiàn)，在肉制品加工過程中膠原蛋白熱力學特性變化對其品質起到一定的影響作用［7］。結締組織濾渣膠原蛋白是肌肉結締組織的提取物，其主要成分為肌束膜和肌內膜結締組織膠原蛋白［8］。研究表明，畜禽肌肉品質在一定程度上受到結締組織濾渣膠原蛋白特性的影響，包括其含量、溶解性以及熱收縮溫度等［4-5］。

本研究以牛半腱肌肉為材料，乳酸、醋酸、檸檬酸和NaCl為腌制劑，探討不同腌制對牛肉結締組織濾渣膠原蛋白特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛半腱肌，選擇來自同一育肥場、品種和飼養(yǎng)管理相同的土種黃牛的改良后代(西門塔爾×南陽黃牛)公牛5頭，屠宰后牛半胴體在4℃冷庫中成熟48h后進行取樣，從半胴體上取下整條半腱肌，所選胴體其大理石花紋、生理成熟度和背膘厚度等指標基本相似，然后分割成2.5cm厚肉塊若干個。

Ⅰ型膠原蛋白標準品(牛跟腱)，美國Sigma公司;標準蛋白樣品 Marker(次高分子質量:43～200kDa)，北京索萊寶科技有限公司(Solarbio);乳酸、醋酸、檸檬酸和NaCl，均為食品級(國產)。其他所用化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

MC-DSC差示掃描量熱儀，美國TA Instrument公司;AllegraTM64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機，美國Beckman-Coulter公司;Alpha2-1.2冷凍干燥機，德國Christ;Ultra-Turrax T25 BASIC高速勻漿器，德國Ika-Werke公司;直插式pH計，英國Thermo Scientific公司;ZKSY-600智能恒溫水箱，南京科爾儀器設備有限公司;Shimadzu AUY120電子天平，日本島津公司;GBF-C-321型雪皇冷藏柜，杭州偉龍制冷設備有限公司;DY602S穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀，南京大學;Universal HoodⅡ凝膠成像儀，美國BIO-RAD公司;TY-80B脫色搖床，南京大學;78-1型磁力攪拌器，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 腌制處理

將牛半腱肌肉(pH值在5.6～5.8)分割成2.5 cm×5.0 cm×5.0 cm大小的肉塊［約(100 ±5)g］若干，隨即分組并稱重，置于下列弱有機酸和NaCl的不同組合腌制劑中，于4℃條件下浸泡腌制24h，其中不經腌制處理的作為對照組。腌制處理組分別為:(1)2%NaCl，(2)1.5%乳酸，(3)1.5%乳酸 +2%NaCl，(4)1.5% 醋酸，(5)1.5% 醋酸 +2%NaCl，(6)1.5%檸檬酸，(7)1.5%檸檬酸 +2%NaCl。每組腌制共6小塊肉樣，肉樣與腌制液之比為1∶5(g∶mL)。腌制完成后，用吸水紙吸干肉塊表面水分，稱重后進行真空包裝，于4℃貯藏待分析。

1.3.2 結締組織濾渣膠原蛋白提取

腌制處理前后肉樣結締組織濾渣膠原蛋白的提取參照 Li等［8］和 Chang 等［9］方法，并作了部分修改。具體方法如下:取50 g肉樣(濕重)，切成約為1 cm3的肉丁，加入50 mL預冷的CaCl2(50 mmol/L)，用高速勻漿器在3 000 r/min絞碎30 s，經尼龍網(100目)過濾，濾渣用40 mL預冷的50 mmol/L CaCl23 000 r/min絞碎20 s，再過濾，上述過程再重復2次。最終得到的濾渣稱為結締組織濾渣膠原蛋白。最后經真空冷凍干燥后稱重，其含量以占樣品濕重的百分比計算。

1.3.3 結締組織濾渣膠原蛋白SDS-PAGE電泳

精確稱取0.5 g膠原蛋白樣品，加入35 mL 0.5 mol/L的醋酸溶液于4℃振蕩溶解48 h。采用不連續(xù)SDS-PAGE電泳系統(tǒng)，參照陸應林等［10］和汪家政等［11］文獻，部分操作條件進行了改進。分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為5%。將結締組織濾渣膠原蛋白溶液(稀釋到濃度約為1 mg/mL)與樣品緩沖液(60 mmol/L Tris-HCl，25% 甘油，2%SDS，14.4 mmol/L2-琉基乙醇，0.1%溴酚蘭，pH 6.8)以體積比 4∶1混勻，在沸水中水浴3～5 min，離心2～3 min，取出冷卻，上樣量為30 μL，次高分子質量蛋白質Marker上樣量為5 μL。在電壓為80 V下恒壓電泳3h。電泳結束之后，用考馬斯亮藍R-250染色液(0.1%考馬斯亮藍R-250，5%甲醇，45%乙酸)染色1 h，在搖床上用考馬斯亮藍脫色液(10%甲醇，10%乙酸)脫色直至背景清晰。用生物電泳圖像分析系統(tǒng)照相，分析。

1.3.4 結締組織濾渣膠原蛋白DSC分析

經分離提取后的結締組織濾渣膠原蛋白用差示掃描量熱儀(DSC)分析其熱量變化(用量5.0 mg)，溫度掃描為20～100℃，升溫速率2℃/min，用TA instrument自帶分析軟件(universal analysis 2000)對熱流變化曲線進行分析，計算樣品熱變性溫度。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

運用SPSS16.0一般線性模型(GLM)對實驗所得數(shù)據(jù)進行單因素方差(ANOVA)分析、LSD多重比較以及相關性分析。各實驗指標值測定重復3次，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 牛肉腌制處理過程中結締組織濾渣膠原蛋白含量的變化

由圖1可見，除乳酸腌制之外，其他腌制處理組牛肉結締組織濾渣膠原蛋白含量與對照組相比均升高，且乳酸腌制組與對照組之間無顯著差異(P＞0.05)。另外，各弱有機酸與NaCl結合腌制處理組牛肉結締組織濾渣膠原蛋白含量較有機酸單獨腌制處理極顯著增高(P＜0.01)。結締組織濾渣主要成分為肌束膜和肌內膜，以及含有部分的肌纖維成分，牛肉中肌束膜成分占膠原蛋白總量的90%以上［12］，是構成結締組織的主要成分，也是決定肉“背景嫩度”的關鍵成分［6］，本研究結果顯示，不同腌制劑的結合處理在一定程度上增加了結締組織濾渣膠原蛋白含量，其原因可能與不同腌液的pH值以及離子強度引起的肌束膜和肌內膜膠原蛋白發(fā)生變性以及凝膠化轉化程度有關，另外，酸與NaCl結合處理時，腌制液pH值較酸單獨處理時更低，腌制液整個系統(tǒng)具有較低的pH值和較高的離子強度，可能對溶解結締組織膠原蛋白以及基質多糖起作用的β-半乳糖苷酶和β-葡糖醛酸酶的釋放和活性受到抑制，因而可提取的結締組織濾渣膠原蛋白含量有所增加。

圖1 三種弱有機酸和NaCl結合腌制過程中牛肉結締組織濾渣膠原蛋白含量的變化Fig.1 Changes in contents of connective tissue filtering residue collagen from beef muscle following marination treatment

2.2 腌制處理過程中牛肉結締組織濾渣膠原蛋白SDS-PAGE電泳

3種弱有機酸和NaCl結合腌制過程中牛肉結締組織濾渣膠原蛋白SDS-PAGE電泳如圖2所示。

圖2 腌制后牛肉結締組織濾渣膠原蛋白SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE of connective tissue filtering residue collagen from beef muscle following marination treatment

由圖2可知，結合Ⅰ型膠原蛋白標準品和對照組(未經腌制處理組)，牛肉經不同腌制處理對結締組織濾渣膠原蛋白不同分子量蛋白濃度的影響不顯著，尤其對40 kDa附近的低分子質量蛋白無顯著降解作用。而前期研究發(fā)現(xiàn)，弱有機酸與NaCl結合腌制對牛肉全肌肉蛋白的降解變化較為顯著［13］，由此可見，這種變化主要源于肌纖維蛋白成分的變化所致。

2.3 腌制處理過程中牛肉結締組織濾渣膠原蛋白熱力特性的變化

弱有機酸結合NaCl不同腌制劑處理過程中牛肉結締組織濾渣膠原蛋白熱力特性的變化見圖3。

圖3 經腌制處理后牛肉結締組織濾渣膠原蛋白熱力特性的變化Fig.3 Changes in thermal shrinkage temperatures of connective tissue filtering residue collagen of beef muscle following marination treatment

由圖3可見，經腌制處理后牛肉結締組織濾渣膠原蛋白Te溫度較對照組相比變化不大，To和Tp溫度有較大變化。各弱有機酸與NaCl結合腌制處理組牛肉結締組織濾渣膠原蛋白變性峰溫度(Tp溫度)較有機酸單獨腌制處理增高，可見，弱有機酸與NaCl結合腌制處理增強了牛肉結締組織濾渣膠原蛋白的熱穩(wěn)定性。

To為結締組織膠原蛋白熱變性起始溫度，反映膠原蛋白的最低熱穩(wěn)定性，Tp為最大熱變性溫度，反映膠原蛋白的一般熱穩(wěn)定性，通常用最大熱變性溫度來反映膠原蛋白的熱穩(wěn)定特性［4，14］。Bailey 等［15］報道哺乳動物膠原蛋白的最大熱變性溫度為65℃左右，但對不同的動物屬種和肌肉類型有也差別。

本研究中，牛肉結締組織濾渣膠原蛋白雖經純化分離，但由于腌制處理過程中，由于不同腌制液pH值以及離子強度的影響，部分處理組肌原纖維和膠原纖維發(fā)生變性，導致分離純化過程中可能還含有極少量的肌原纖維成分，另外，肌束膜和肌內膜耐受腌制處理影響程度表現(xiàn)不一致，即受破壞程度不同，二者共同決定了肌肉結締組織濾渣膠原蛋白的熱力特性。

2.4 相關性分析

在牛肉腌制處理過程中，對牛肉結締組織濾渣膠原蛋白含量以及熱力特性之間的相關性分析見表1。

表1 經腌制處理后牛肉結締組織濾渣膠原蛋白特性變化相關性分析Table 1 Correlation analysis among the characteristic changes of beef connective tissue filtering residue collagen following marination treatment(n=24)

由表1相關性分析可知，牛肉結締組織濾渣膠原蛋白含量與其熱穩(wěn)定性之間相關性不顯著，而結締組織濾渣膠原蛋白最大變性溫度(Tp峰溫度)與最終變性溫度(Te溫度)之間呈極顯著相關，相關系數(shù)為0.844。

3 結論

牛肉經3種弱有機酸(乳酸、醋酸和檸檬酸)以及和NaCl的結合腌制處理使得結締組織濾渣膠原蛋白含量和熱力特性發(fā)生了一定程度的變化。與對照組相比，NaCl以及3種不同腌制劑的結合處理在一定程度上增加了結締組織濾渣膠原蛋白含量。牛肉經不同腌制處理對結締組織濾渣膠原蛋白不同分子質量蛋白濃度的影響不顯著。3種弱有機酸與NaCl結合腌制處理增加了牛肉結締組織濾渣膠原蛋白熱變性峰溫度，表明其熱穩(wěn)定性更加趨于穩(wěn)定。

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