田晶，孫崢，曾常茜

(1．圖們市石峴鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院，吉林 圖們 133101;2．大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044;3．大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧省生物有機重點實驗室，遼寧 大連 116622)

本課題組前期實驗已證實，透骨草(Phryma leptostachya L．var．a(chǎn)siatica Hara)提取物對人卵巢癌 SKOV－3細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用［1－2］，但其相關(guān)的分子機制尚不清楚。本實驗采用吖啶橙染色法觀察透骨草提取物對SKOV－3細(xì)胞形態(tài)的影響，并用免疫組化方法檢測透骨草提取物對SKOV－3細(xì)胞凋亡相關(guān)分子 Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7蛋白表達的影響，旨在繼續(xù)對透骨草提取物抑制SKOV－3細(xì)胞增殖的分子機制進行探討，以期為卵巢癌的治療尋找新的藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 藥品、試劑及儀器

透骨草采自遼寧金州大黑山，經(jīng)王心毓老先生鑒定為透骨草科植物 Phryma leptostachya L．var．a(chǎn)siatica Hara，加熱回流提取濃縮成干膏;鼠抗人Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7抗體(Cell Signaling Technology公司);SP免疫組化試劑盒、DAB顯色液(福州邁新生物技術(shù)公司);RPMI 1640、小牛血清和胰蛋白酶(美國GIBCO公司);熒光顯微鏡(CX41，日本 Olympus公司)。

1．2 細(xì)胞系及培養(yǎng)

人卵巢SKOV－3細(xì)胞由吉林省腫瘤研究所提供;將SKOV－3細(xì)胞接種于含10%小牛血清、100 IU/ml青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分組。實驗組加入37．8μg/ml透骨草提取物(終濃度)，對照組加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1．3 吖啶橙染色法觀察SKOV－3細(xì)胞形態(tài)變化

收集實驗組和對照組的SKOV－3細(xì)胞，用PBS緩沖液洗2次，1000r/min離心5min，用PBS緩沖液調(diào)整SKOV－3細(xì)胞濃度為1×1010個/L。取1×1010個/L細(xì)胞懸液95μl，加入0．1g/L 吖啶橙 5μl(終濃度 5μg/ml)，置37℃孵箱中染色10min。取10μl SKOV－3細(xì)胞懸液滴于玻片上，封片，置熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1．4 免疫組化法檢測 SKOV－3細(xì)胞 Caspase－9、Caspase－3和Caspase－7蛋白表達變化

免疫組化法采用SP法。分別收集實驗組和對照組的SKOV－3細(xì)胞，涂片，丙酮固定;3%H2O2室溫孵育15min，消除內(nèi)源性過氧化物酶;正常山羊血清室溫孵育 15min，封閉非特異性抗原;分別與鼠抗人Caspase－9、Caspase－3和 Caspase－7抗體37℃孵育2h，PBS洗3次;與生物素標(biāo)記二抗室溫孵育15min，PBS洗3次;與ABC液室溫孵育10min，PBS洗3次。DAB染色，封片，顯微鏡下觀察，細(xì)胞漿出現(xiàn)棕色判斷為陽性細(xì)胞，無棕色者為陰性細(xì)胞，計數(shù)200個細(xì)胞并計算陽性細(xì)胞的比例。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理

Caspase－9、Caspase－3和 Caspase－7蛋白表達的陽性率用(±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2．1 透骨草提取物對SKOV－3細(xì)胞形態(tài)的影響

未用透骨草提取物處理的對照組SKOV－3細(xì)胞形態(tài)比較規(guī)則，胞核較大且染色均勻。經(jīng)37．8μg/ml透骨草提取物作用于SKOV－3細(xì)胞24h后，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核固縮呈月牙形緊貼在核膜周圍。

2．2 透骨草提取物對 SKOV－3細(xì)胞 Caspase－9、Caspase－3和Caspase－7蛋白表達的影響

未用透骨草提取物處理的對照組SKOV－3細(xì)胞Caspase－9蛋白高表達，細(xì)胞漿著棕黃色的細(xì)胞量多，經(jīng)37．8μg/ml透骨草提取物處理后的SKOV－3細(xì)胞Caspase－9蛋白表達與對照組相比明顯降低(P＜0.05);未用透骨草提取物處理的對照組SKOV－3細(xì)胞Caspase－3蛋白高表達，細(xì)胞漿著棕黃色的細(xì)胞量多，經(jīng)37．8μg/ml透骨草提取物處理后的SKOV－3細(xì)胞Caspase－3蛋白表達明顯降低(P＜0．05);未用透骨草提取物處理的對照組SKOV－3細(xì)胞Caspase－7蛋白高表達，細(xì)胞漿著棕黃色的細(xì)胞量多，經(jīng)37．8μg/ml透骨草提取物處理后的SKOV－3細(xì)胞Caspase－7蛋白表達明顯降低(P＜0．05)，詳見表1。

表1 免疫組化法檢測SKOV－3細(xì)胞Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7蛋白表達結(jié)果(±s，n=3，%)

表1 免疫組化法檢測SKOV－3細(xì)胞Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7蛋白表達結(jié)果(±s，n=3，%)

注:與對照組比較，△P ＜0．05。

Caspase－9 Caspase－3 Caspase－7對照組組別44．1 ±1．3 49．9 ±1．4 45．5 ±1．3實驗組 11．1±1．4 12．6±1．0△ 13．1±0．7△

3 討論

卵巢癌是婦科腫瘤中病死率最高的疾病，發(fā)病率呈不斷上升趨勢，尋找治療卵巢癌的新藥物是目前亟待解決的問題。本實驗用吖啶橙染色法觀察透骨草提取物對人卵巢癌SKOV－3細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果顯示，37．8μg/ml透骨草提取物作用后的SKOV－3細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核固縮緊貼在核膜周圍呈月牙形，說明透骨草提取物可誘導(dǎo)SKOV－3細(xì)胞凋亡。

Caspase半胱氨酸蛋白酶家族引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡過程的中心環(huán)節(jié)，Caspase－9為凋亡始動子，位于級聯(lián)反應(yīng)上游，能在其他蛋白參與下發(fā)生活化并激活下游的凋亡效應(yīng)子Caspase－3、Caspase－7等，并通過切割特異性底物，引起細(xì)胞凋亡［3－4］。近期實驗研究表明，藥物誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡與卵巢癌細(xì)胞Caspases級聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)［5－8］。透骨草提取物是否通過Caspases級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)SKOV－3細(xì)胞凋亡尚不清楚，本實驗用免疫組化法檢測透骨草提取物對SKOV－3細(xì)胞Caspases家族蛋白表達的影響。結(jié)果顯示，37．8μg/ml透骨草提取物作用SKOV－3細(xì)胞24h后，Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7蛋白表達水平與對照組相比均顯著下降，說明透骨草提取物可能通過激活 Caspase－9、Caspase－3、Caspase－7蛋白酶的級聯(lián)反應(yīng)，引起SKOV－3細(xì)胞凋亡。

綜上所述，透骨草提取物能誘導(dǎo)SKOV－3細(xì)胞凋亡，其機制與激活Caspases級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。卵巢癌細(xì)胞凋亡是一個多基因參與的復(fù)雜過程，透骨草提取物是否通過其凋亡相關(guān)蛋白誘導(dǎo)SKOV－3細(xì)胞凋亡，有待進一步深入研究。

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