劉峰，張恒，李靜，溫學(xué)森，劉彥飛

(1．青島市海慈醫(yī)療集團，山東 青島 266033;2．山東大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)研究所，山東 濟南 250012)

地黃為玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa)的塊根，是重要的補益類中藥之一。梓醇(catalpol)是一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷，是地黃的主要有效成分之一，近年來活性研究主要集中在神經(jīng)保護［1－3］、抗癌［4］、降血糖［5］、抗肝炎病毒［6］及抗銀屑?。?］等方面，特別是在抗老年性癡呆方面顯示出了巨大的開發(fā)潛力［8］。梓醇在地黃的加工炮制過程中含量明顯下降，與地黃經(jīng)加工炮制藥效發(fā)生改變可能有某種聯(lián)系。為探討其加工過程中的含量下降情況，本文進行了研究。

1 儀器、試劑及試藥

島津LC－10AT輸液泵(配合SPD－10A紫外－可見檢測器);浙大智達N2000色譜工作站;梓醇對照品(自制，含量＞99．2%);鮮地黃(山東鼎立中藥材科技有限公司);磷酸、乙腈為色譜純;高純水(自制);其他試劑為分析純。

2 色譜條件

Phenomenex Luna C18色譜柱(250mm×4.60mm，5μm)，流動相乙腈－1‰磷酸(1∶99);流速 1.0mL/min;進樣體積15μL，檢測波長210nm，柱溫室溫。理論塔板數(shù)按梓醇峰計不低于9000。

3 實驗方法及結(jié)果

3．1 地黃加工過程中pH值的變化及梓醇的含量變化

3．1．1 地黃加工過程中pH值的變化

取鮮地黃約1．5kg，分別置于電熱鼓風(fēng)箱中，設(shè)置溫度分別為60℃、70℃、80℃、90℃4組，在不同時間點各切取每塊鮮地黃上的一部分，榨汁，降溫至室溫，pH計測定其pH值，同時設(shè)對照組，計算失重。

結(jié)果顯示，溫度越高，pH值下降越快，見圖1。

圖1 地黃加工過程中pH值的變化

3．1．2 地黃加工過程中梓醇的含量變化

將電熱鼓風(fēng)箱中干燥的各組樣品，研成粗粉，取約0．4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定重量，加熱回流1．5h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10mL，濃縮至近干，殘渣用流動相溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，過0．22μm濾膜，取續(xù)濾液15μL進樣，HPLC測定。

結(jié)果顯示，不同溫度下加工的地黃中梓醇的含量差別顯著，60℃、70℃、80℃、90℃各組溫度加工條件下地黃中梓醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3．3%、2．8%、2．6%、1．5%，和未加工前的鮮地黃中梓醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比，分別下降了 14．9%、27．9%、33．9%、61．4%，可見加工溫度越高，梓醇含量越低。

3．2 模擬地黃加工過程中pH值的變化及梓醇的含量變化

3．2．1 模擬地黃加工過程中pH值的變化

取5℃預(yù)冷鮮地黃約1．5kg榨汁，分裝到5個300mL的錐形瓶中，分別設(shè)置溫度5℃、60℃、70℃、80℃、90℃5組，20min后均達到各自設(shè)定溫度，在0h、0．5h、1．5h、3．5h、7．5h、15．5h、25．5h、37．5h、49．5h、61．5h等10個時間點各組均取出約20mL懸浮液，降溫至室溫，pH計測定其pH值。

結(jié)果顯示，5℃條件下，pH值下降緩慢，而其他組均有明顯下降，特別是60℃和90℃下降更為明顯，見圖2。

圖2 模擬地黃加工過程中pH值的變化

3．2．2 模擬地黃加工過程中梓醇的含量變化

3．2．2．1 供試品的制備 樣品榨汁后，在上述各時間點均取各組供測 pH值的樣品約2g，精密稱定，置25mL量瓶中，精密加入25mL甲醇，稱定重量，超聲提取20min，再稱定重量，甲醇補重，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10mL，濃縮至近干，殘渣用流動相溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，過0.22μm濾膜，取續(xù)濾液進樣15μL進樣，HPLC測定梓醇含量。

3．2．2．2 對照品溶液的制備 精密稱定梓醇對照品25．00mg，置25mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，避光冷藏，作為貯備液備用。

3．2．2．3 線性關(guān)系考察 將梓醇質(zhì)量濃度分別為0.0625、0．125、0．25、0．375、0．5、0．75、1mg/mL 的對照品溶液分別精密注入15μL進行測定。以峰面積值(X)對質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Y)作回歸計算，r=0．9999，回歸方程Y=6×10－7X－0．0061。表明梓醇在進樣量0.9375～15μg之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3．2．2．4 精密度實驗 取同一對照品溶液，連續(xù)進樣5次，每次15μL，測定峰面積，梓醇峰面積平均值為1629740，RSD=0．36%，表明精密度良好。

3．2．2．5 重現(xiàn)性實驗 精密稱取同一樣品5份，按上述方法測定，RSD=0．74%，說明本法具有良好的重現(xiàn)性。

3．2．2．6 穩(wěn)定性實驗 取新配制的供試品溶液，于0、2、4、6、8h 進樣測定，其峰面積平均值為 788042．8，RSD=0．17%，表明供試品溶液中梓醇在8h內(nèi)穩(wěn)定。

3．2．2．7 加樣回收率實驗 取樣品約1g，精密稱定，置三角瓶中，精密加入梓醇對照品一定量，其余操作同供試品液制備項下的方法，測定5份，計算平均回收率為97．5%，RSD 為2．06%。

圖3 模擬地黃加工過程中梓醇的含量變化(7．5h)

圖4 模擬地黃加工過程中梓醇的含量變化(61．5h)

結(jié)果顯示，樣品在升溫到各組設(shè)定溫度過程中含量下降顯著，且溫度越低，含量下降越顯著，0．5h時測定5℃、60℃、70℃、80℃、90℃5 組的梓醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 2%、2．53%、2．74%、2．81%、2．84%，與最初含量相比分別下降了 44．9%、30．3%、24．5%、22．6%、21．8%;到7．5h時，5℃組的梓醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)已經(jīng)下降了95．3%，60℃、70℃、80℃三組樣品中梓醇含量基本與0．5h持平，見圖3;61．5h時，5℃組梓醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0，60℃、70℃、80℃三組樣品中梓醇含量基本與前持平，90℃組出現(xiàn)了較明顯下降，梓醇含量比最初下降了43．8%，見圖4。

4 討論

4．1 地黃加工及模擬加工過程中pH值的變化

在地黃加工過程中，可能是溫度的升高導(dǎo)致了地黃中所含的蛋白質(zhì)分解為偏酸性的多肽類物質(zhì)或者游離的氨基酸，從而使地黃內(nèi)部呈酸性，溫度越高，越有利于蛋白質(zhì)的分解。而在模擬加工過程中，60℃條件下的pH值偏低可能是由于此溫度下某些可以分解地黃中苯乙酰苷類及地黃腦苷的酶比較活潑，酶解苷鍵斷裂釋放出芳香酸類、脂肪酸類及多酚類物質(zhì)所致。

4．2 酶對于梓醇在地黃加工過程中的含量下降的影響

已有研究證明，鮮地黃中含有β－葡萄糖苷酶［9］，在加工過程中溫度的升高可能導(dǎo)致了地黃中細(xì)胞核核膜和液泡膜的破裂從而使β－葡萄糖苷酶和梓醇相遇引起梓醇降解，溫度越高梓醇降解程度越高，說明可能是存在著這樣一個平衡，即細(xì)胞破裂的時間和酶滅活的時間有一個先后問題，溫度越高酶滅活越快，同時細(xì)胞破裂也越快，事實上可能是溫度越高，細(xì)胞破裂所需的時間越短，從而使β－葡萄糖苷酶和梓醇相遇，在更大程度上引起了梓醇的降解。而在模擬地黃加工條件下，榨汁使酶和梓醇已充分接觸，因而溫度越高，酶滅活的越快，梓醇的降解在更大程度上受到了抑制。

4．3 pH值對于梓醇在地黃加工過程中的含量下降的影響

一方面，酶可以酶解糖苷鍵，另一方面，氫離子也可以酸解糖苷鍵，地黃加工過程中不斷下降的酸性環(huán)境可能在后期影響了梓醇的降解，值得注意的是，在鮮地黃內(nèi)部呈弱酸性，加工是在高溫的條件下進行的，而作者測定的pH值是在室溫下進行的，考慮到氫離子的濃度受溫度的影響(對于弱酸性的物質(zhì)，溫度越高，氫離子濃度越大)，所以事實上地黃內(nèi)部的真實pH值應(yīng)該比作者測定的更低，這樣，當(dāng)氫離子達到一定濃度后，就可能酸解梓醇的糖苷鍵，致使梓醇含量下降。

4．4 梓醇的量與地黃質(zhì)量的關(guān)系

目前對道地藥材的研究中發(fā)現(xiàn)，對于一些公認(rèn)質(zhì)量較好的道地藥材，其道地性，即優(yōu)質(zhì)性，在化學(xué)成分上往往表現(xiàn)為一個量的范圍，所以盡管文獻報道地黃中梓醇的含量相差幅度較大，但從某種程度上來講，只要梓醇含量在一定幅度范圍，就應(yīng)該可以起到發(fā)揮其藥效的作用。例如在研究梓醇的對神經(jīng)保護和衰老細(xì)胞的作用時，梓醇起作用的量大大低于《中國藥典》規(guī)定的量，盡管如此，我們應(yīng)該盡量減少鮮地黃加工過程中梓醇的降解，從而更多的保留其有效成分，更好的發(fā)揮其藥效。

那么，地黃中的β－葡萄糖苷酶的最適溫度的確定、地黃的細(xì)胞破裂條件以及梓醇降解成何新物質(zhì)，將是下一步研究的重要內(nèi)容。

［1］ Li DQ，Duan YL，Bao YM，et al．Neuroprotection of catalpol in transient global ischemia in gerbils［J］．Neuroscience Reaearch，2004，50(2):169．

［2］ Li DQ，B YM，Li Y，et al．Catalpol modulates the expressions of Bcl－2 and Bax and attenuates apoptosis in gerbils after ischemic injury［J］．Brain Research，2006，1115(1):179．

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［4］ Pungitore CR，Ayub MJ，Borkowski EJ，et al．Inhibition of Taq DNA polymerase by catalpol［J］．Cell Mol Biol(Noisy－le－grand)，2004，50(6):767．

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［8］ 王金紅，孫啟祥，夏宗勤，等．地黃活性成分梓醇對轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞 M2受體的調(diào)節(jié)作用［J］．中國藥理學(xué)通報，2006，22(12):1462．

［9］ 趙宇，溫學(xué)森，崔晶，等．鮮地黃中α－半乳糖苷酶和β－葡萄糖苷酶的提取與初步純化［J］．中藥材，2006，29(2):137．