海參體壁膠原纖維簡化制備方法及其特性分析

商文慧 朱祉默 孫世廣 吳海濤

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

海參（Stichopusjaponicus）屬棘皮動物門，是一種珍貴的海洋無脊椎動物，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值。2012年，中國海參產(chǎn)量已達到17.08萬t［1］，海參體壁是海參的主要食用部位，體壁中膠原占總蛋白的70%［2］，具有極大的開發(fā)價值。

研究［3］發(fā)現(xiàn)，海參膠原纖維是膠原分子高度交聯(lián)的聚合體，若不進行特殊的處理，只有很少的膠原能夠溶解。本課題組的前期研究［4］也發(fā)現(xiàn)：與魚皮膠原蛋白不同，利用含有β－巰基乙醇、尿素及十二烷基硫酸鈉等變性劑的溶液也并不能直接從海參體壁中溶解出膠原蛋白，海參體壁中的膠原成分必需經(jīng)過化學處理后才能被電泳檢測。目前，在海參體壁膠原蛋白的制備過程中，獲得膠原纖維是進一步提取的前提，再利用胃蛋白酶水解，從而促進膠原蛋白的溶解［5－7］。傳統(tǒng)提取海參膠原纖維的方法步驟繁瑣，提取時間長，亟待建立新的簡化方法。

本研究在前期提取海參酶促溶性膠原蛋白［6，7］的基礎上，對原料預處理方法進行了改進。以十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）為檢測手段，考察水洗滌、緩沖溶液洗滌、堿溶液洗滌對海參體壁膠原纖維制備的影響，建立了海參體壁膠原纖維簡易提取方法，并對獲得膠原纖維進行鑒定，為深入研究海參體壁膠原蛋白的理化特性及開發(fā)應用奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 海參

海參購自大連旅順，新鮮海參經(jīng)剖殺后，去嘴和內臟，并去除內壁中的肌肉層，取體壁部分貯藏于－80℃。

1.2 儀器與試劑

數(shù)顯勻漿機：T25型，德國IKA公司；

微量臺式離心機：Micro 17R型，美國Thermo Scientific公司；

冷凍離心機：CF 16XⅡ型，日本HITACHI公司；

垂直電泳儀槽：AE-6450型，日本ATTO公司；

凝膠成像儀：MF-ChemiBIS 2.0型，以色列DNR Bio-imaging公司；

pH計：Satorius型，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；

液相色譜：P1201型，大連依利特分析儀器有限公司。

丙烯酰胺、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺、N，N-四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸鈉、過硫酸銨、甘氨酸、巰基乙醇等生化試劑：上海生工生物工程有限公司；

蛋白質分子量標準品：寶生物工程（大連）有限公司；

2，4-二硝基氟苯（DNFB）、N，N-二甲基甲酰胺：色譜純，大連依利特分析儀器有限公司；

其他試劑均為分析純。

為詳細說明上文所提的動態(tài)過程，我們針對特朗普總統(tǒng)2017年《報告》，從時間、空間和情態(tài)三個方面，具體分析《報告》如何采用趨近化策略將中國識解為不斷迫近的威脅，從而實現(xiàn)促使美國政府增加軍事開支以及實施貿(mào)易保護等政治意圖。

1.3 方法

1.3.1 海參體壁膠原纖維的提取 如下所有操作除特殊注明外，均在4℃下進行。取100g新鮮海參體壁，切碎后，加入100mL去離子水（0℃）勻漿，控制勻漿機轉速為3 000～5 000r/min，為防止勻漿過程中產(chǎn)熱對原料的影響，本試驗勻漿分多次完成，每次勻漿約30s，間隔時間約15s，待原料均勻后14 500×g離心15min，棄上清，重復水洗步驟1～3次。經(jīng)水洗的海參勻漿組織加入10倍（m/V）的0.1mol/L pH 8.0Tris—HCl緩沖液（含5mmol/L EDTA 和0.5mol/L NaCl），緩慢攪拌8h，14 500×g離心15min，棄上清。經(jīng)緩沖液洗滌的海參勻漿組織加入10倍（m/V）4℃0.1mol/L NaOH攪拌72h，14 500×g離心15min，棄上清。沉淀用去離子水洗至中性，得到海參體壁膠原纖維。

1.3.2 各因素對海參體壁膠原纖維電泳檢測的影響

（1）水洗次數(shù)對海參體壁膠原纖維電泳檢測的影響：對海參膠原纖維提取過程中水洗步驟進行考察，逐步進行1，2，3次的水洗流程，分別取沉淀。再按照1.3.1的方法進行提取，NaOH溶液洗滌為72h，分別在Tris—HCl緩沖液洗滌和NaOH溶液洗滌后的離心步驟中收集沉淀。進一步進行SDS—PAGE電泳檢測，以研究水洗次數(shù)對海參體壁膠原纖維的影響。

（2）堿洗時間對海參體壁膠原纖維電泳檢測的影響：對海參膠原纖維提取過程中堿洗步驟進行考察，水洗次數(shù)為3次，按照1.3.1的方法進行Tris—HCl緩沖液洗滌，再分別將沉淀用NaOH溶液洗滌24，48，72h后離心，收集沉淀。進一步進行SDS—PAGE電泳檢測，以研究堿洗時間對海參體壁膠原纖維的影響。

（3）堿液濃度對海參體壁膠原纖維電泳檢測的影響：對海參膠原纖維提取過程中堿洗步驟進行考察，水洗次數(shù)為3次，按照1.3.1的方法進行Tris—HCl緩沖液洗滌，再分別將沉淀用不同濃度的 NaOH 溶液（0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10mol/L）洗滌24h后離心，收集沉淀。進一步進行SDS—PAGE電泳檢測，以研究堿液濃度對海參體壁膠原纖維的影響。

1.3.3 SDS—PAGE電泳檢測 取一定待檢測的樣品，加入等體積5×上樣緩沖液（250mM pH 7.5Tris—HCl緩沖液、8 M尿素、5%SDS、5%巰基乙醇），100℃煮沸5min，震蕩過夜，16 500×g離心后取上清，進行SDS—PAGE電泳檢測。濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為8%，電泳緩沖液采用SDS—Tris—甘氨酸體系。電泳完畢后，進行考馬斯亮藍R-250染色，脫色后成像。

1.3.4 紅外光譜分析 取適量冷凍干燥后的海參膠原纖維和干燥后的溴化鉀，置于瑪瑙研缽中，研磨成粉后，裝樣壓片。采用紅外光譜儀對樣品在400～4 000cm－1區(qū)間進行掃描。

1.3.5 氨基酸分析

（1）樣品預處理：取25mg海參體壁膠原纖維，于安醅瓶中加入3mL 6mol/L鹽酸，封口后在110℃水解24h。水解后樣品轉移至蒸發(fā)皿，水浴蒸干。衍生緩沖溶液多次洗滌蒸發(fā)皿，轉入25mL容量瓶定容，0.45μm微孔濾膜過濾，備用。

（2）樣品衍生化：取樣品液10mL于棕色試劑瓶，加5mL衍生試劑，混勻后60℃水浴，暗處反應60min。反應完畢，冷卻至室溫，加平衡緩沖溶液定容，0.45μm微孔濾膜過濾，利用依利特P1201液相色譜進行分析。

1.3.6 氨基酸測序 將海參膠原纖維的電泳條帶切膠回收，委托國家生物醫(yī)學分析中心進行序列測定。采用胰蛋白酶進行膠內酶切。采用nanoACQUITY超高液相色譜儀系統(tǒng)（Waters公司）進行納升級電噴霧分離。使用BEH C18色譜柱，色譜柱參數(shù)為：75μm×250mm，1.7μm顆粒大小，并使用99%流動相A（水溶液中含0.1%甲酸）和1%流動相B（乙腈中含有0.1%甲酸）。將nanoACQUITY超高液相色譜儀連接至Synapt G2質譜儀（Waters，Milford，MA）。源溫度為100℃，質譜儀采集域為350～1 600，二級質譜儀50～2 000。原始數(shù)據(jù)使用ProteinLynx Global Server version 2.3（PLG2.3，Waters）處理，將其上傳至內部服務器并能夠通過Mascot檢索軟件進行MS/MS離子方式檢索數(shù)據(jù)庫。

2 結果與討論

2.1 水洗次數(shù)對海參體壁膠原纖維電泳檢測的影響

由圖1可知，海參體壁經(jīng)1～3次的水洗步驟，沉淀中的蛋白質組分并未發(fā)生太大的改變，蛋白質分子量主要為2 00kDa。值得注意的是，海參體壁經(jīng)一次水洗后，電泳污染較為嚴重，主要為多糖的干擾。經(jīng)進一步水洗后，多糖對電泳的干擾現(xiàn)象有所緩解，但并未去除。前期的研究［5］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，海參體壁經(jīng)電泳緩沖液浸提，獲得的主要為2 00kDa的非膠原蛋白質，這與本研究結果一致。水洗后的海參體壁勻漿經(jīng)Tris—HCl緩沖液洗滌后，多糖干擾極大降低，分子量為200，66.4～97.2kDa的非膠原蛋白質也被緩沖液溶解。進一步經(jīng)NaOH溶液洗滌后，可見清晰的電泳條帶，主要位于116～2 00kDa，與典型的膠原蛋白α亞基位置相同。由以上結果可見，不同洗滌步驟可有效地去除海參體壁中非膠原蛋白，且堿洗是去除海參體壁非膠原蛋白和促進膠原組織溶脹的重要步驟，因此，進一步對該步驟進行優(yōu)化。

圖1 水洗次數(shù)對海參體壁膠原纖維電泳檢測的影響Figure 1 Effect of rinsing times on electrophoretic analysis of collagen fibers from sea cucumber body wall

2.2 堿洗時間對海參體壁膠原纖維電泳檢測的影響

由圖2（a）可知，經(jīng)NaOH溶液洗滌24，48，72h后均有海參膠原蛋白電泳條帶檢出。而適當縮短洗滌時間后（12，16，20h），電泳檢測均未出現(xiàn)膠原條帶（圖2（b））。NaOH溶液洗滌是提取水產(chǎn)品膠原的常用方法，不僅能夠去除原料中的非膠原物質，而且還能夠使緊密結合的膠原組織溶脹。浸提時間長短決定了膠原組織的溶脹程度，從而促進膠原纖維蛋白溶解于電泳上樣緩沖液中，被SDS—PAGE電泳檢出。根據(jù)上述結果，選擇NaOH洗滌24h為堿處理的適宜洗滌時間。

2.3 堿液濃度對海參體壁膠原纖維電泳檢測的影響

圖2 堿洗時間對海參體壁膠原纖維電泳檢測的影響Figure 2 Effect of wash time of NaOH solution on electrophoretic analysis of collagen fibers from sea cucumber body wall

圖3 堿液濃度對海參體壁膠原纖維電泳檢測的影響Figure 3 Effect of concentration of NaOH solution on electrophoretic analysis of collagen fibers from sea cucumber body wall

由圖3可知，采用不同濃度NaOH溶液處理海參體壁膠原纖維，均得到116～200kDa的條帶。同時也發(fā)現(xiàn)，堿溶液濃度越低，獲得的沉淀越疏松，會對沉淀的收集造成一定的影響。因而，采用0.1mol/L NaOH溶液濃度為適宜堿濃度。

2.4 海參體壁膠原纖維的紅外光譜分析

采用水洗3次、Tris—HCl洗滌8h和0.1mol/L NaOH溶液洗滌24h的條件，對海參體壁膠原纖維進行提取，經(jīng)凍干后，呈現(xiàn)白色、纖維狀。進一步對海參體壁膠原纖維進行理化分析。由圖4可知，海參體壁膠原纖維最主要的吸收帶在酰胺帶處，包括酰胺 A帶（3 340cm－1）、酰胺Ⅰ帶（1 661cm－1）、酰胺Ⅱ帶（1 557.3cm－1）和酰胺Ⅲ帶（1 238.4cm－1），這與海參酶促溶性膠原蛋白的紅外光譜相似［6］。酰胺 A帶（3 340cm－1）與海參體壁膠原纖維分子N—H的收縮震動有關［8］，低于非膠原蛋白（3 400～3 440cm－1）的波數(shù)。酰胺Ⅰ帶（1 661cm－1）證明海參體壁膠原纖維分子處于交聯(lián)狀態(tài)［9］。酰胺Ⅱ帶（1 557.3cm－1）與N—H彎曲振動有關，而酰胺Ⅲ帶（1 238.4cm－1）與N—H彎曲振動和C—N伸縮振動有關。

圖4 海參體壁膠原纖維紅外光譜圖Figure 4 Infrared spectrogram of collagen fibers from sea cucumber body wall

2.5 海參體壁膠原纖維的氨基酸組成

由表1可知，海參體壁膠原纖維的甘氨酸含量為（3 2.34±0.06）%，約占總氨基酸1/3，這與海參酶促溶性膠原蛋白中的甘氨酸含量相近［6，8］。海參體壁膠原纖維中脯氨酸，羥脯氨酸的含量分別為7.75%，5.10%，其含量略低于海參酶促溶性膠原蛋白［6，8］。

2.6 氨基酸測序

膠原蛋白的定性分析主要包括紅外光譜分析、氨基酸組成分析、紫外光譜分析和圓二色譜分析。由于受到海參膠原纖維溶解性的限制，紫外光譜分析和圓二色譜分析無法進行。由于本研究采用SDS—PAGE電泳檢測的方法對海參膠原纖維簡化提取步驟進行了跟蹤，所以對2.2中得到的海參體壁膠原纖維蛋白條帶進行切膠，采用氨基酸測序分析方法進一步分析。結果顯示，其隨機片段 Gly-Leu-Pro-Gly-Ala-Arg-Gly－Ser-Asn-Gly-Asn-Asp-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Phe-Asp－Gly-Pro-Glu-Gly-Pro-Arg與球海膽（Paracentrotuslividus）I型膠原蛋白前體相同。

表1 海參體壁膠原纖維氨基酸分析Table 1 Amino acid composition of collagen fibers from sea cucumber body wall

針對海參體壁膠原纖維，Matsumura等［9］采用含有0.5MNaCl、0.05MEDTA、0.2Mβ－巰基乙醇和0.1MTris—HCl緩沖溶液（pH 8.0）處理海參體壁，組織被分解，用酸溶液提取可以獲得完整的膠原纖維。Trotter等［10］改進了海參膠原蛋白的提取方法，采用適當?shù)碾x子強度EDTA溶液實現(xiàn)了海參膠原的提取。Saito等［11］采用β－巰基乙醇，0.1mol/L的NaOH處理海參組織，使膠原纖維溶脹，再加入一定量的胃蛋白酶進行消化，大部分的膠原纖維完全溶解到液體中。本研究利用簡易方法，從海參體壁中提取獲得膠原纖維，經(jīng)理化特性分析其具有典型的膠原蛋白特性，其提取時間由傳統(tǒng)的7d縮短為2d。

3 結論

（1）采用水洗3次、Tris—HCl洗滌8h和0.1mol/L NaOH溶液洗滌24h的條件可獲得海參體壁膠原纖維，其凍干品呈現(xiàn)白色、纖維狀。

（2）海參體壁膠原纖維經(jīng)紅外光譜、氨基酸組成及序列分析，具有典型的膠原蛋白特性。利用簡易方法獲得的海參體壁膠原纖維，針對其溶解性的改善還有待于進一步的研究。

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