UPLC-MS/MS法測(cè)定奶粉中煙酸的含量

文∕郝 剛 俞蘊(yùn)莉 顧炳仁

（1江蘇省蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所；2江蘇省蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院）

煙酸（Nicotinic Acid），又名尼克酸、維生素B3（或維生素PP），是人體必需的13 種維生素之一，具有促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝和擴(kuò)張血管等功能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。目前，市售的眾多品牌奶粉中均將煙酸作為重要的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行添加。本試驗(yàn)基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）技術(shù)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式（MRM），建立了快速測(cè)定奶粉中煙酸含量的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITY UPLC Xevo TQ-S三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Waters公司；電噴霧離子源（ESI+）；Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Waters）；Thermo低溫離心機(jī)；KQ-300DA型數(shù)控型超聲波清洗器；MILLIPORE純水儀；強(qiáng)陽(yáng)離子交換（SCX）固相萃取柱（北京明尼克分析儀器設(shè)備中心）。

1.2 樣品與試劑

煙酸對(duì)照品（批號(hào)201102，含量99.9%），購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙酸銨，購(gòu)于Sigmaaldrich公司；甲醇，色譜純，購(gòu)于Merk公司；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉等均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥試劑有限公司。試驗(yàn)用水為超純水。試驗(yàn)所用樣品均為市售奶粉。

1.3 UPLC 色譜條件

色譜柱：BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A（含20 mmol/L乙酸銨的水溶液）∶B（甲醇）=20∶80（v/v）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣盤溫度：4 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；毛細(xì)管電壓4.0 kV；脫溶劑氣溫度：350 ℃；脫溶劑氣體流量：800 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；碰撞氣體為氬氣，碰撞能18 eV；多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）下，測(cè)定煙酸的檢測(cè)離子對(duì)分別為：m/z 124→106和m/z 124→80。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取煙酸對(duì)照品約10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，作為煙酸對(duì)照品儲(chǔ)備液（10 μg/mL），4 ℃避光保存。臨用前用甲醇稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.6 樣品前處理

稱取1 g奶粉置于燒杯中，加入適量的45～50 ℃的溫水將其溶解，冷卻至室溫后，加水補(bǔ)足100 mL，充分溶解、混勻后，取10 mL樣品溶液于50 mL聚丙烯離心管中；加入10 mol/L的氫氧化鈉0.1 mL、5 g氯化鈉和40 mL水，渦旋振蕩3 min，8 000 r/m離心5 min。取上清液10 mL置于另一個(gè)50 mL聚丙烯離心管中，加入0.2 mol/L的鹽酸40 mL，渦旋振蕩3 min，8 000 r/m離心5 min，取上清液10 mL上樣至SCX小柱中。然后依次用3 mL水，1 mL 0.2 mol/L的鹽酸和3 mL甲醇淋洗，用4 mL氨水-甲醇（體積比1∶3）洗脫，洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笥昧鲃?dòng)相定容至10 mL，0.22 μm濾膜過(guò)濾，取1 μL濾液進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

將煙酸對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成200 ng/mL的對(duì)照溶液，選用ESI+離子化模式，通過(guò)直接進(jìn)樣法進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。首先，采用一級(jí)質(zhì)譜掃描方式得到煙酸準(zhǔn)分子離子峰m/z：124[M+H]+，結(jié)果如圖1－（A）所示。在確定準(zhǔn)分子離子的基礎(chǔ)上，進(jìn)行錐孔電壓優(yōu)化，得到最佳錐孔電壓為30 V，錐孔氣流量為150 L/h。再通過(guò)Daughter Scan掃描模式，對(duì)煙酸的分子離子進(jìn)行二級(jí)碎片離子掃描，結(jié)果如圖1－（B）所示。煙酸二級(jí)掃描的特征離子對(duì)為：m/z 124→106和m/z 124→80，這2 個(gè)特征離子對(duì)作為煙酸定性判斷的依據(jù)。最后，基于煙酸的2 個(gè)特征離子對(duì)建立MRM方法，煙酸的MRM離子流色譜圖如1－（C）所示，并選擇其中響應(yīng)較強(qiáng)的離子對(duì)（m/z 124→80）作為定量離子對(duì)。

圖1 質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

2.2 專屬性

分別取空白奶粉（經(jīng)測(cè)定不含煙酸的奶粉樣品），空白奶粉添加至200 ng/mL水平的煙酸對(duì)照品，按“1.6 樣品前處理”方法經(jīng)提取、固相萃取后進(jìn)樣分析。同時(shí)用甲醇配制200 ng/mL的煙酸對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，考察所建立方法的專屬性，結(jié)果如圖2所示。煙酸對(duì)照品溶液的MRM離子流色譜圖保留時(shí)間為0.45 min，空白樣本在該保留時(shí)間處無(wú)干擾，空白樣品添加煙酸對(duì)照品溶液后，MRM離子流色譜圖保留時(shí)間不變，且峰形良好，所建液相及質(zhì)譜方法適合奶粉中煙酸的定性、定量檢測(cè)。

圖2 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 線性范圍

取煙酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別配制成終濃度為1，2，5，20，50，100，200，500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述液相及質(zhì)譜方法，各取1 μL進(jìn)樣分析，采集MRM離子流色譜圖，以m/z 124→80為定量離子對(duì)，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，煙酸在1～500 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，線性方程為Y=9855X+93501，相關(guān)系數(shù)：R=0.9995。

圖3 煙酸線性范圍考察結(jié)果

2.4 檢出限與定量限

2.4.1 儀器檢出限與定量限

空白奶粉溶液中分別添加至0.1 ng/mL和0.3 ng/mL濃度水平的煙酸對(duì)照品，經(jīng)提取、固相萃取后，進(jìn)樣分析，結(jié)果如圖4－（A）所示，0.1 ng/mL濃度的煙酸信噪比（S/N）為6.8，該濃度作為煙酸的儀器檢出限（S/N>3）；0.3 ng/mL濃度的煙酸信噪比（S/N）為13.97（如圖4－（B）所示），該濃度作為煙酸的儀器定量限（S/N>10）。

圖4 煙酸檢出限（A）、定量限（B）試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 方法檢出限與定量限

根據(jù)“1.6 樣品前處理”的方法，樣品實(shí)際稀釋倍數(shù)為2 500 倍，計(jì)算該方法下的方法檢出限為0.25 μg/g，方法定量限為0.75 μg/g。

2.5 回收率和精密度

取空白奶粉溶液，分別添加2 ng/mL，20 ng/mL，200 ng/mL共3 個(gè)濃度水平的煙酸對(duì)照品溶液，按本試驗(yàn)方法進(jìn)行處理，每份樣品重復(fù)測(cè)定6 次，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示?？疾鞜熕岬?、中、高3 個(gè)濃度下的方法回收率，在78.2%～90.4%范圍內(nèi)，方法精密度（以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示）小于7%。

表1 空白樣品中煙酸的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

選取市售6 種不同批次標(biāo)示含有煙酸成分的奶粉，按所建方法進(jìn)行樣品處理并檢測(cè)煙酸含量，結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，6 種批次奶粉中煙酸含量的實(shí)測(cè)值均在“80%標(biāo)示值～120%標(biāo)示值”范圍內(nèi)，符合我國(guó)《食品營(yíng)養(yǎng)成分標(biāo)示準(zhǔn)則》的相關(guān)規(guī)定。

表2 奶粉樣品分析結(jié)果

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)煙酸含量的方法主要包括滴定法、微生物法、高效液相色譜法、電化學(xué)法、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用法等。我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中煙酸的測(cè)定方法為高效液相色譜法和微生物法（GB 5413.15－2010）。本試驗(yàn)基于超高效液相色譜的快速分離能力及三重四級(jí)桿質(zhì)譜的定性、定量?jī)?yōu)勢(shì)，開發(fā)快速測(cè)定奶粉中煙酸含量的檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，不含煙酸的空白奶粉樣品經(jīng)提取、固相萃取后，在MRM監(jiān)測(cè)模式下對(duì)煙酸的基線分離無(wú)影響，方法專屬性強(qiáng)，且煙酸保留時(shí)間僅為0.45 min，大大縮短了分析時(shí)間。進(jìn)一步分析目前市售各種品牌的奶粉營(yíng)養(yǎng)成分表發(fā)現(xiàn)，多數(shù)品牌奶粉中煙酸的含量在1～10 mg/100 g范圍內(nèi)，本試驗(yàn)中所建立的煙酸對(duì)照品溶液的線性范圍為1～500 ng/mL。結(jié)合所建方法的提取、固相萃取過(guò)程，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)和回收率的計(jì)算結(jié)果，該方法運(yùn)用在實(shí)際樣品的檢測(cè)中，線性范圍可達(dá)0.25～125 mg/100 g，基本滿足目前市售的不同品牌奶粉中煙酸的測(cè)定要求，且方法回收率在78.2%～90.4%范圍內(nèi)，精密度小于7%。進(jìn)一步運(yùn)用所建方法對(duì)市售6 批奶粉中的煙酸含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均符合規(guī)定。綜上所述，本試驗(yàn)所建立的奶粉中煙酸含量檢測(cè)方法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度高、線性范圍廣、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，為奶粉中煙酸的檢測(cè)提供了新的選擇。

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