豬血多肽對建鯉抗氧化能力和免疫功能的影響

王加豪 賈 睿， 劉英娟 杜金梁 曹麗萍 殷國俊，*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，無錫 214081;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/魚類免疫藥理學(xué)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，無錫 214081)

生物活性肽是一類在生物體內(nèi)對生物活動具有調(diào)節(jié)作用的肽類化合物［1］，具有易吸收、促進(jìn)免疫、抗菌、抗病毒等優(yōu)點(diǎn)，其種類繁多，主要有乳肽、玉米肽、畜產(chǎn)肽等，是當(dāng)前國際研究最熱門以及最有發(fā)展前景的功能因子。目前，國內(nèi)外研究人員已從不同來源的蛋白質(zhì)中提取到各種具有抗氧化活性的肽類物質(zhì)［2］，Hattori等［3］、Suetsuna等［4］、Suetsuna 等［5］分別從不溶性的彈性蛋白、酪蛋白和沙丁魚中分離得到了抗氧化肽。豬血在我國是很好的蛋白質(zhì)源，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值［6］，但由于其自身具有分子質(zhì)量大、難消化等缺點(diǎn)，嚴(yán)重影響了豬血在我國養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用［7］。而豬血多肽(peptides from swine blood，PSB)的出現(xiàn)，則彌補(bǔ)了豬血的這些缺點(diǎn)，豬血多肽是利用微生物發(fā)酵豬血而分離獲得的一類具有多種生物活性的短肽，它具有易吸收、利用率高等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。方俊等［8］研究發(fā)現(xiàn)，豬血多肽對于機(jī)體中的自由基具有明顯的清除作用，顯示其具有較強(qiáng)的抗氧化能力。關(guān)于豬血多肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用未見相關(guān)報(bào)道。

本研究以建鯉(Cyprinus carpio var.Jian)為試驗(yàn)對象，用豬血多肽和飼料混合喂養(yǎng)健康無傷的建鯉，在不同階段取血樣、頭腎，通過檢測血清中各種抗氧化酶活性的變化以及蛋白質(zhì)濃度的變化，并結(jié)合體外試驗(yàn)測定的指標(biāo)變化來評價(jià)豬血多肽對建鯉抗氧化能力和免疫功能的影響，為豬血蛋白質(zhì)源生物活性肽在魚類飼料中的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)用建鯉取自中國水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心漁場，所選建鯉健康無傷、平均體重在100 g左右，飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中，水溫27℃，每天投喂配制的飼料2次。

1.2 藥品和試劑

豬血多肽購自北京漁經(jīng)生物技術(shù)有限公司，為分子質(zhì)量＜1 ku的小肽混合物。

細(xì)菌脂多糖(LPS)、L-15培養(yǎng)基、杜氏磷酸鹽緩沖液(D-PBS)、二甲基亞砜(DMSO)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、佛波豆寇乙酸酯(PMA)、Hank’s平 衡 鹽 溶 液 (HBSS)、鏈 霉 素/青 霉 素(streptomycin/penicillin，S/P)、肝素(heparin)購于美國Sigma公司;胎牛血清(FCS)和細(xì)胞培養(yǎng)板購于GIBCO生物技術(shù)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、堿性磷酸酶(AKP)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)活性及總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)含量等測定試劑盒購自于南京建成生物工程研究所;白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、補(bǔ)體 3(C3)、補(bǔ)體 4(C4)含量測定試劑盒購自于上海朝瑞生物科技有限公司，WST-1試劑盒購自于碧云天生物技術(shù)研究。

1.3 體外試驗(yàn)

1.3.1 建鯉頭腎巨噬細(xì)胞和外周血白細(xì)胞的分離

采用 Bayne［9］和曹麗萍等［10］的方法分離建鯉頭腎巨噬細(xì)胞和外周血白細(xì)胞。將分離的細(xì)胞濃度調(diào)整為 107個(gè)/mL。接種到 96孔板上，每孔100μL，27℃培養(yǎng)2 h后，洗去未貼壁細(xì)胞，加入100μL L-15培養(yǎng)基(含1%S/P和5%FCS)，27℃培養(yǎng)備用。

將培養(yǎng)備用的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，再加入含有不同濃度 (10、20、40、80 μg/mL)豬血多肽的L-15培養(yǎng)基100μL，同時(shí)設(shè)空白對照(加入等量L-15培養(yǎng)基)和陽性對照(加入等量含500μg/mL LPS的L-15培養(yǎng)基)，作用24 h后，分別檢測白細(xì)胞增殖能力和巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性。

1.3.2 外周血白細(xì)胞增殖能力的測定

白細(xì)胞增殖能力通過WST-1(是一種高度水溶性的四唑鹽)試劑盒檢測。將細(xì)胞以每孔1×104個(gè)/mL的量接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別用含不同濃度豬血多肽(10、20、40、80 μg/mL)的L-15培養(yǎng)基進(jìn)行處理，每孔加入100μL，然后每孔加入10μL WST-1孵育2 h，每孔混合均勻后選擇450 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的吸光度值，記錄結(jié)果。共測定8尾魚，每尾魚為1個(gè)重復(fù)。

1.3.3 頭腎巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性的測定

氧呼吸爆發(fā)和氮呼吸爆發(fā)活性均根據(jù)Yin等［11］的方法進(jìn)行檢測，其結(jié)果用吸光度值表示，共測定8尾魚，每尾魚為1個(gè)重復(fù)。

1.4 體內(nèi)試驗(yàn)

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將初始體重為(100±2)g的建鯉隨機(jī)分為5組，即1個(gè)對照組和4個(gè)試驗(yàn)組，每組20尾。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料(表1)，基礎(chǔ)飼料中不添加豬血多肽;4個(gè)試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼料中添加0.5(PSB0.5 組)、1.0(PSB1 組)、2.0(PSB2 組)和5.0 g/kg(PSB5組)豬血多肽的試驗(yàn)飼料。飼養(yǎng)8周，期間分4次采集血液，采集時(shí)間分別在試驗(yàn)第1、2、4、8 周。

1.4.2 血清制備

每組選8尾建鯉，從尾靜脈采血，血樣在4℃冰箱中靜置4 h后，4℃下4 000 r/min離心10 min制備血清，每尾魚均單獨(dú)制備血清，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 血清生化指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)測定

按照試劑盒操作說明，分別測定血清中SOD、CAT、AKP、GSH-Px活性以及TP和ALB含量。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis)%

1.4.4 血清免疫指標(biāo)測定

參照試劑盒操作說明，分別測定血清中IL-1β、TNF-α、C3、C4 含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SD)表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件包中的單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重化比較處理，對樣本(空白對照組與試驗(yàn)組之間)進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬血多肽對體外培養(yǎng)建鯉細(xì)胞性能的影響

由表2可知，LPS能顯著提高建鯉外周血白細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)也可以增強(qiáng)頭腎巨噬細(xì)胞的氮呼吸爆發(fā)和氧呼吸爆發(fā)活性，說明經(jīng)檢測的離體培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)是正常的。當(dāng)用不同濃度的豬血多肽處理白細(xì)胞后，白細(xì)胞的增值能力隨著濃度的提高出現(xiàn)了不同的變化。與空白對照組相比，各濃度豬血多肽組的細(xì)胞增殖能力均有所提高，濃度為20和 40μg/mL的組提高顯著(P＜0.05)，濃度為 80μg/mL的組提高極顯著(P＜0.01)。與空白對照組相比，添加40和80μg/mL豬血多肽顯著增強(qiáng)了建鯉頭腎巨噬細(xì)胞氮呼吸爆發(fā)活性(P＜0.05)。與空白對照組相比，添加40μg/mL豬血多肽顯著增強(qiáng)了建鯉頭腎巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性(P＜0.05)，添加 80μg/mL豬血多肽極顯著增強(qiáng)了建鯉巨噬細(xì)胞氧呼吸爆發(fā)活性(P＜0.01)。

2.2 豬血多肽對建鯉血清生化指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)的影響

豬血多肽對建鯉血清生化指標(biāo)的影響結(jié)果見表3。與對照組對比，在第1周，PSB2和PSB5組血清中 TP含量顯著增加(P＜0.05);在第2周，PSB5組血清中TP含量顯著增加(P＜0.05);在第4和8周，PSB1、PSB2和 PSB5組血清中 TP含量均顯著增加(P＜0.05)。

與對照組相比，在第1、2和4周，各試驗(yàn)組血清中ALB含量沒有顯著變化(P＞0.05);在第8周，PSB1、PSB2和PSB5組血清中ALB含量均顯著增加(P＜0.05)。此外，在第 4周，PSB2和 PSB5組血清中 ALB含量顯著高于 PSB0.5組(P＜0.05)。

與對照組相比，在第1周，PSB5組血清中AKP活性顯著升高(P＜0.05);在第 2周，PSB1、PSB2和PSB5組血清中AKP活性顯著升高(P＜0.05);在第4周，各試驗(yàn)組血清中AKP活性均顯著升高(P＜0.05);在第 8周，PSB2和 PSB5組血清中AKP活性顯著升高(P＜0.05)。

表2 豬血多肽對體外培養(yǎng)建鯉細(xì)胞性能的影響(以O(shè)D值計(jì))Table 2 Effects of PSB on properties of Jian carp cells cultured in vitro(as expressed by OD value)

表3 豬血多肽對建鯉血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of PSB on serum biochemical indices of Jian carp

2.3 豬血多肽對建鯉血清抗氧化指標(biāo)的影響

豬血多肽對建鯉血清抗氧化指標(biāo)的影響結(jié)果見表4。

與對照組相比，在第1和2周，PSB2和PSB5組血清中 CAT活性顯著升高(P＜0.05);在第4周，PSB5組血清中CAT活性顯著升高(P＜0.05);在第8周，PSB1、PSB2和PSB5組血清中CAT活性顯著升高(P＜0.05)。

與對照組相比，在第1周，PSB2和PSB5組血清中SOD活性顯著升高(P＜0.05);在第2、4和8周，僅 PSB5組血清中SOD活性顯著升高(P＜0.05)，其他試驗(yàn)組沒有顯著變化(P＞0.05)。

與對照組相比，在第1和2周，各試驗(yàn)組血清中GSH-Px活性沒有顯著變化(P＞0.05);在第4和8周，僅PSB5組血清中GSH-Px活性顯著升高(P＜0.05)，其他試驗(yàn)組沒有顯著變化(P＞0.05)。

表4 豬血多肽對建鯉血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of PSB on serum antioxidant indices of Jian carp U/mL

2.4 豬血多肽對建鯉血清免疫指標(biāo)的影響

豬血多肽對建鯉血清免疫指標(biāo)的影響結(jié)果見表5。

與對照組相比，在第1周，各試驗(yàn)組血清中IL-1β含量沒有顯著變化(P＞0.05);在第 2周，PSB2和PSB5組血清中IL-1β含量顯著升高(P＜0.05);在第4周，PSB5組血清中 IL-1β含量顯著升高(P＜0.05);在第 8周，PSB2和 PSB5組血清中 IL-1β 含量顯著升高(P＜0.05)。

與對照組相比，在第1周，PSB0.5組血清中TNF-α 含量顯著降低(P＜0.05);在第 2 周，各試驗(yàn)組血清中TNF-α含量沒有顯著變化(P＞0.05);在第4和8周，PSB2和PSB5組血清中TNF-α含量顯著升高(P＜0.05)。

與對照組相比，在第1周，PSB0.5和PSB1組血清中C3含量顯著降低(P＜0.05)，隨著豬血多肽添加量的升高，血清中C3含量是逐漸升高的;在第2和4周，各試驗(yàn)組血清中C3含量沒有顯著變化(P＞0.05);在第 8周，PSB2和 PSB5組血清中 C3 含量顯著升高(P＜0.05)。

與對照組對比，在第1和2周，各試驗(yàn)組血清中C4含量沒有顯著變化(P＞0.05);在第4周，PSB2和PSB5組血清中 C4含量顯著升高(P＜0.05);在第 8周，PSB1、PSB2和 PSB5組血清中C4 含量顯著升高(P＜0.05)。

3 討論

3.1 豬血多肽對體外培養(yǎng)建鯉細(xì)胞性能的影響

巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是宿主防御系統(tǒng)的重要組成部分，是魚類最重要的免疫活性細(xì)胞之一，在識別、吞噬外來病原體，處理和呈遞抗原，激活淋巴細(xì)胞啟動特異性免疫應(yīng)答以及分泌淋巴因子等方面發(fā)揮重要作用［12-14］，其活性與功能是反映和評價(jià)魚類免疫水平的重要指標(biāo)［15］。巨噬細(xì)胞有助于內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)態(tài)免受外部環(huán)境的干擾，活化的巨噬細(xì)胞可以釋放多種免疫因子，如一氧化氮(NO)、IL-1β、TNF-α和活性氧中間體等物質(zhì)，在宿主防御病原體和任何類型的浸潤細(xì)胞(包括癌細(xì)胞)中發(fā)揮重要作用［15］。Kim 等［16］認(rèn)為 NO 是由巨噬細(xì)胞分泌的，可以通過格里斯(Griess)反應(yīng)測定亞硝酸鹽濃度。需特別指出的是，由巨噬細(xì)胞釋放的NO是一種高反應(yīng)性的自由基，在調(diào)節(jié)各種免疫應(yīng)答中起重要作用。

本研究試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加40和80μg/mL豬血多肽可以顯著或極顯著增強(qiáng)建鯉頭腎巨噬細(xì)胞氮呼吸爆發(fā)和氧呼吸爆發(fā)活性。Matar等［17］、Meisel等［18］研究均表明，乳酸菌發(fā)酵釋放的多肽有助于調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)某些細(xì)胞因子的生產(chǎn)，刺激巨噬細(xì)胞的吞噬活動。Migliore-Samour等［19］研究表明，由酪蛋白衍生的免疫肽，在對抗由肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)引起的微生物感染中起顯著作用，這種作用已經(jīng)在小白鼠試驗(yàn)中得到證實(shí)。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，表明豬血多肽有助于提高頭腎巨噬細(xì)胞的免疫活性，從而增強(qiáng)建鯉自身的非特異性免疫機(jī)能。

表5 豬血多肽對建鯉血清免疫指標(biāo)的影響Table 5 Effects of PSB on serum immune indices of Jian carp ng/mL

3.2 豬血多肽對建鯉血清生化指標(biāo)的影響

建鯉血清中ALB和TP含量反映魚體健康、營養(yǎng)以及代謝狀況，同時(shí)也間接反映機(jī)體非特異性免疫水平的高低［20］。TP主要是由ALB和球蛋白(GLB)組成的，血清TP含量高表明機(jī)體蛋白質(zhì)代謝旺盛，有利于機(jī)體對蛋白質(zhì)的吸收和利用，同時(shí)可以降低飼料消耗。ALB是脊椎動物血漿中含量豐富且容易純化的一種蛋白質(zhì)，是血液系統(tǒng)的重要成分，能夠結(jié)合和運(yùn)輸多種內(nèi)源性以及外源性物質(zhì)，清除自由基，并在抗凝血以及抑制血小板功能等生理過程中發(fā)揮一定功能［21］。本試驗(yàn)中，用添加豬血多肽的飼料飼喂建鯉后，測定結(jié)果表明血清TP和ALB含量隨著豬血多肽添加量的升高而升高，表明豬血多肽對建鯉機(jī)體的新陳代謝是有積極影響的，對建鯉抗氧化能力的提升也具有一定的促進(jìn)作用。趙紅霞等［22］研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加谷胱甘肽(GSH)能夠增強(qiáng)草魚蛋白質(zhì)的合成作用。李清等［23］研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加生物活性肽可以顯著降低建鯉血清中尿素氮含量，有利于提高蛋白質(zhì)的合成效率。葉均安等［24］研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺二肽對于日本對蝦TP合成也具有一定促進(jìn)作用。

AKP是一種在生物體代謝調(diào)控中起重要作用的代謝調(diào)控酶，直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和鈣、磷代謝，在吸收和利用營養(yǎng)物質(zhì)的過程中起重要作用，AKP可以改變病原體表面結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)機(jī)體對病原體的識別和吞噬能力［25］。本試驗(yàn)中，與對照組相比，飼料中添加5.0 g/kg豬血多肽對建鯉血清中AKP活性有顯著的增強(qiáng)作用。鋅是合成AKP必需的金屬離子，豬血多肽有助于促進(jìn)AKP活性的增強(qiáng)可能與豬血多肽中含有鋅離子有關(guān)。郭存榮等［26］研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加不同濃度的魚蛋白多肽-鋅配合物可以增加羅非魚血清中AKP活性，并有隨著濃度增加而增加的趨勢，從而增強(qiáng)其免疫力。

3.3 豬血多肽對建鯉血清中抗氧化酶活性的影響

抗氧化劑包括酶促和非酶促2個(gè)部分，在當(dāng)前科學(xué)研究中，SOD、CAT、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)、GSH-Px等逐漸引起重視［27］。機(jī)體中由SOD、GSH-Px和CAT等組成的抗氧化酶系統(tǒng)，是防自由基損傷的第1道防線，其活性變化能準(zhǔn)確反映機(jī)體內(nèi)的抗氧化狀態(tài)［28-30］。豬血蛋白經(jīng)菌株發(fā)酵，發(fā)酵液過濾后可以得到分子質(zhì)量在2 ku以下的豬血多肽混合物，這種混合物對部分活性氧自由基具有強(qiáng)力的清除作用。有研究表明，經(jīng)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老ICR小鼠，口服攝入水母復(fù)合蛋白酶水解制備的膠原蛋白，可增加小鼠血清SOD和GSH-Px活性，同時(shí)伴隨血清和肝臟中丙二醛(MDA)含量的大量減少［31］。這與本試驗(yàn)的結(jié)果是一致的。在本試驗(yàn)中，用含豬血多肽的飼料飼喂建鯉后，建鯉血清中SOD和CAT活性隨著豬血多肽添加量的升高呈逐漸升高的趨勢，且PSB5組較對照組顯著升高，GSH-Px活性也有不同程度的升高，表明豬血多肽能夠提高建鯉體內(nèi)一些抗氧化酶的活性，有助于提高建鯉的抗氧化能力。

3.4 豬血多肽對建鯉血清中免疫因子含量的影響

血清中存在多種的免疫因子，如白介素、腫瘤壞死因子、C3和C4等，測量血清免疫指標(biāo)是對機(jī)體免疫水平的體現(xiàn)［32-34］。巨噬細(xì)胞可以釋放多種細(xì)胞因子，如 NO、IL-1β、TNF-α 和活性氧中間體等物質(zhì);C3是血清中含量最高的補(bǔ)體成分，主要由巨噬細(xì)胞和肝臟合成;C4是一種多功能β1-球蛋白，在活化補(bǔ)體、促進(jìn)吞噬、防止免疫復(fù)合物沉著和中和病毒等方面發(fā)揮作用［35］。TNF-α、IL-1β對于宿主受損或非正常細(xì)胞和組織的恢復(fù)起一定重要作用。方俊等［36］研究表明，豬血多肽能夠提高正常小鼠以及環(huán)磷酸酰胺所致免疫功能低下小鼠的免疫功能，并認(rèn)為豬血多肽能夠從多個(gè)方面增強(qiáng)小鼠的免疫功能，其中最主要的是增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞的機(jī)能。劉清海等［37］研究表明，黑鯛口服微生物多肽后，血清中C3和C4含量顯著升高，多種免疫球蛋白的含量也顯著增加。李清等［23］研究也表明，隨著生物活性肽用量的增加，鯉魚血清中免疫球蛋白M(IgM)和C4的含量顯著增加。這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果是一致的，表明豬血多肽可以促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，提高建鯉的免疫功能。

4 結(jié)論

① 在體外試驗(yàn)中，豬血多肽濃度在40和80μg/mL時(shí)，建鯉外周血白細(xì)胞的增殖能力顯著提高，頭腎巨噬細(xì)胞的氮呼吸爆發(fā)和氧呼吸爆發(fā)活性也顯著增強(qiáng)。

② 在體內(nèi)試驗(yàn)中，飼料中添加5.0 g/kg豬血多肽對提高建鯉的抗氧化能力和免疫功能具有很好的效果。

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