徐 進(jìn)， 徐學(xué)明， 金征宇， 王 強， 范雪榮

（1．江南大學(xué) 紡織服裝學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

淀粉回生是糊化后的淀粉分子鏈經(jīng)氫鍵締合形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)趨于有序化形成晶體的過程，它是米飯、面包、糕點等淀粉基食品在貯藏過程中變硬、干縮、掉渣等問題的主因[1]。因此，淀粉回生導(dǎo)致食品可接受程度降低和巨大的經(jīng)濟損失，是制約我國主食工業(yè)化的主要問題之一。

利用淀粉酶來抑制淀粉回生，一直是研究淀粉抗回生應(yīng)用的熱點。但從文獻(xiàn)報道α-淀粉酶抑制面包老化的機理來看，該機理目前還存在一些爭議。Miyazak等[2]報道在制作面包過程中加入小相對分子質(zhì)量的糊精可抑制淀粉的老化，但小相對分子質(zhì)量糊精的添加與面包變硬沒有潛在的關(guān)系。Hug-Iten等[3]對實驗結(jié)果的分析則認(rèn)為：α-淀粉酶抑制面包老化的效果是由于淀粉的部分水解導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化所引起。 然而，León等[4]研究認(rèn)為，α-淀粉酶延緩面包老化并不是水解改變其結(jié)構(gòu)，而是水解產(chǎn)物（糊精）起到延緩面包老化的作用，因為León等在加入糖化酶（glucoamylase）除去糊精后，面包老化延緩的效果就隨之消失。Akers和Hoseney的研究結(jié)果[5]也證實，α-淀粉酶抑制面包變硬效果與α-淀粉酶水解淀粉所產(chǎn)生的麥芽糊精相對分子質(zhì)量大小和比例都密切相關(guān)。此外，Witczak等[6]研究結(jié)果表明，高DE值（尤其是DE 18.0和DE 21.8）的麥芽糊精能夠有效降低淀粉老化速率。因此，α-淀粉酶抑制淀粉回生研究結(jié)果的不一致說明目前對α-淀粉酶抑制面包老化的機理尚未研究透徹。

雖然文獻(xiàn)報道α-淀粉酶水解淀粉生成的糊精延緩淀粉的回生，但并未詳細(xì)研究是直鏈還是支鏈的糊精片段延緩淀粉回生。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，直鏈糊精片段可以影響淀粉回生程度[7]，但分支結(jié)構(gòu)的糊精片段是否影響淀粉回生尚待考察。作者通過添加極限糊精到小麥淀粉中，考察分支結(jié)構(gòu)的糊精片段對小麥淀粉回生的影響，并結(jié)合分子動力學(xué)模擬的方法為α淀粉酶抑制淀粉回生機理提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 小麥淀粉：購于天津頂峰淀粉開發(fā)有限公司。

1.1.2 試劑 α-淀粉酶（來源于地衣芽孢桿菌）、β-淀粉酶（來源于大麥）：購于美國Sigma-Aldrich公司；乙酸、乙酸鈉、無水乙醇等試劑：均為市售國產(chǎn)試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

SII X-DSC7000型差示掃描量熱儀：日本SII NanoTechnology公司產(chǎn)品；D8 ADVANCE廣角X射線衍射儀：德國Bruker公司產(chǎn)品；Optima L-80XP型超速離心機：美國貝克曼公司產(chǎn)品；Hyperchem8.0軟件：美國Hypercube公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備極限糊精及其SE-HPLC分析相對分子質(zhì)量分布 取100 g小麥淀粉，加蒸餾水配置成5%的淀粉乳。完全糊化后，用0.02 mol/L、pH 5.0的醋酸緩沖液將淀粉糊調(diào)節(jié)至α-淀粉酶最適作用pH值（pH 6.0），加入α-淀粉酶，然后置于60℃的恒溫水槽中酶解24 h后，再將α-極限糊精溶液的pH值調(diào)節(jié)至β-淀粉酶最適作用范圍（pH 5.5），然后加入β-淀粉酶，置于55℃的恒溫水槽中酶解48 h，最終將反應(yīng)液煮沸30 min滅酶活。極限糊精溶液再加入無水乙醇使乙醇濃度分別達(dá)到為75%（F75）和88%（F88），進(jìn)行分級沉淀，采用超速離心的方法分步收集沉淀，并將沉降物冷凍干燥，粉碎，過200目篩。上述制備的極限糊精取0.1 g溶解于5 mL溶液蒸餾水中，將其稀釋到100 mL后再在45℃保溫2 h。所制備的溶液經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾，取濾液10 μL在 SE-HPLC上使用 Shodex OHpark SB-804 HQ（8.0 mm× 300 mm，i.d.6 μm）柱分析。

1.3.2 WXRD測定淀粉回生 將1 g極限糊精（F75）溶解于20 mL蒸餾水中，再將9 g小麥淀粉加到極限糊精溶液中。用磁力攪拌器攪拌均勻后移入玻璃管中，將其密封后沸水浴糊化1 h，樣品放置冷卻至室溫，放入4℃冰箱保存120 h。極限糊精（F88）的回生樣品也按照上述方法制備。采用D8 ADVANCE廣角X射線衍射儀對上述所制備的回生樣品進(jìn)行WXRD測定[8]。

1.3.3 DSC測定淀粉回生 分別稱量3 mg極限糊精與小麥淀粉的物理混合物 （質(zhì)量比為5∶95或 10∶90）于鋁盒中，用微量進(jìn)樣器添加6 μL蒸餾水后密封，平衡24 h。平衡的樣品以10℃/min的速率從20℃升溫至90℃，樣品冷卻至室溫，放入4℃冰箱分別保存 24、72、120、360、720 h 后，以 10 ℃/min 的速率從20℃升溫至90℃，記錄樣品回生焓變（ΔH）。測定時以空坩堝為參比，氮氣流速為20mL/min。

1.3.4 分子動力學(xué)模擬 采用Hyperchem 8.0軟件模擬極限糊精與淀粉片段之間的相互作用。根據(jù)極限糊精和淀粉片段的分子尺寸設(shè)定模擬的邊界條件為 40 ?×30 ?×50 ?。 其中淀粉分子片段由 15 個葡萄糖殘基以左螺旋的方式連接組成。由于模擬軟件的邊界參數(shù)最大可設(shè)置為5 nm，因此淀粉片段的分支點（α，1-6鍵連接）并未設(shè)定在本模擬實驗中。所有建立的模型在分子動力學(xué)模擬前均使用Amber力場進(jìn)行構(gòu)象優(yōu)化計算。分子動力學(xué)模擬DSC測試變溫過程：能量優(yōu)化的模型首先在1 ps內(nèi)加熱90℃后（糊化），并在90℃平衡2 ps，再從90℃降溫到4℃（回生）。

2 結(jié)果與討論

2.1 極限糊精的相對分子質(zhì)量表征

小麥淀粉通過α-淀粉酶和β-淀粉酶復(fù)合水解得到極限糊精溶液，采用乙醇分步沉淀的方法得到兩個組分（F75和 F88），組分 F75和 F88的 SE-HPLC 見圖1。從圖1可知，采用乙醇分步沉淀法已將極限糊精分為不同平均相對分子質(zhì)量大小的極限糊精。極限糊精的保留時間（tR）隨乙醇濃度的增大而增大，說明F75組分的相對分子質(zhì)量較F88大。通過標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量校正可知F75和F88的平均相對分子質(zhì)量分別為 2 861.2（18）和 1 455.4（9）。

圖1 SE-HPLC測定極限糊精的高效液相色譜圖Fig.1 SE-HPLC chromatographic molecular weight profile of limit dextrin

2.2 X射線衍射分析

X射線衍射圖譜見圖2。可以看出：所有的樣品在2θ角=17°時均呈現(xiàn)出回生淀粉的特征峰（B型衍射峰），其反映的是六角形晶胞β-直鏈淀粉100個晶面之間的距離[9]，亦說明小麥淀粉在糊化后失去其天然存在的A型結(jié)晶。此外，在圖2中觀察到所有的小麥淀粉樣品2θ為19.7°都有一個衍射峰，這個衍射峰歸屬于直鏈淀粉與脂質(zhì)形成復(fù)合物的V型結(jié)晶特征峰[10]，該峰的出現(xiàn)說明本實驗中淀粉樣品中殘存脂質(zhì)。小麥淀粉中加入10%的極限糊精，回生樣品的相對結(jié)晶度均小于不加極限糊精的小麥淀粉回生的相對結(jié)晶度。這個現(xiàn)象可以用Gidley和Bulpin[11]研究成果解釋：DP＜9的淀粉鏈片段在濃度為35%和50%的溶液中，4℃的條件下可至少穩(wěn)定2個月。換言之：小相對分子質(zhì)量的糊精片段不會發(fā)生回生，從而導(dǎo)致極限糊精抑制小麥淀粉回生。

圖2 小麥淀粉回生的廣角X射線衍射圖譜Fig.2 WXRD pattern of the retrograded wheat starch

2.3 DSC分析

融化回生的直鏈淀粉或直鏈淀粉與脂復(fù)合物需要較高的溫度（≥90℃）[12]，而在本實驗中測定淀粉回生焓值時所關(guān)注的溫度則是低于90℃的范圍。此外，小麥淀粉樣品在4℃保存時間長達(dá)720 h，所以測定的融化重結(jié)晶焓值變化（ΔH）對應(yīng)的是支鏈淀粉的回生焓值。糊化的小麥淀粉在4℃存貯24～720 h后，再次使用DSC程序升溫掃描樣品測試其ΔH，見表1。隨著小麥淀粉的回生，回生熱流峰出現(xiàn)在55.97℃（±1.28℃），這與前期研究的結(jié)果相符[13]，在此溫度附近的ΔH是由回生的支鏈淀粉解鏈所形成。隨著存貯時間的延長，回生焓值逐漸增大。與未添加極限糊精的小麥淀粉對照樣相比，添加極限糊精的小麥淀粉樣回生ΔH顯著降低。在相同的條件下，添加F88的小麥淀粉回生ΔH小于添加F75的小麥淀粉回生ΔH。這很可能是由于F88的平均相對分子質(zhì)量較F75小的緣故，因為分子質(zhì)量越小的組分在低溫下其流動性更強。總之，上述結(jié)果說明添加極限糊精可降低小麥淀粉回生程度。Würsch等[14]研究結(jié)果表明，DP 6-9的糊精片段能抑制淀粉回生。因此，表1中小麥淀粉回生ΔH的變化說明了極限糊精很可能與小麥淀粉發(fā)生相互作用，起到抑制小麥淀粉回生的作用。

表1 小麥淀粉重結(jié)晶焓變和Avrami重結(jié)晶動力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of wheat starch retrogradation

Avrami方程指數(shù)（n）反映的是成核過程的晶體形態(tài)，而速率常數(shù)（k）反映的是結(jié)晶過程的速度，因此Avrami方程（公式1）常用于淀粉回生動力學(xué)研究[15]。

從表1可以發(fā)現(xiàn)，隨小麥淀粉中加入不同種類和比例的極限糊精，小麥淀粉的結(jié)晶速率常數(shù)k值隨之改變。在本研究中，小麥淀粉樣品的Avrami指數(shù)（n）說明所有的淀粉樣品回生的成核模式都為瞬時一維生長。

2.4 分子動力學(xué)模擬分析

WXRD和DSC數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)88極限糊精組分抑制小麥淀粉回生的效果較F75極限糊精組分顯著，且SE-HPLC顯示F88極限糊精組分的平均相對分子質(zhì)量為1 455.4（9）。因此，選擇DP為9的極限糊精與淀粉片段 （DP15）作為分子模擬的對象（圖3a為DP 9的極限糊精在真空中的幾何優(yōu)化構(gòu)象）。 經(jīng)過升溫（2 ps）和降溫過程（3 ps）的分子動力學(xué)模擬，得到極限糊精與淀粉片段相互作用的最低能量構(gòu)象（圖3b）。此外，回生的淀粉片段在同樣的升溫和降溫模擬后得到（圖3c）。圖4a是極限糊精與淀粉片段的加水混合體系首先經(jīng)構(gòu)象優(yōu)化，在1 ps中模擬加熱到90℃及維持在90℃條件下動力學(xué)模擬1 ps，該動力學(xué)模擬過程相當(dāng)于淀粉的糊化過程。而極限糊精與淀粉片段的回生過程則是將糊化的淀粉片段體系進(jìn)行降溫模擬（從90℃降溫到4℃），讓體系達(dá)到一個低能量的動態(tài)平衡（見圖4b）。由圖4b可知降溫模擬1 ps后整個極限糊精與淀粉片段加水混合體系達(dá)到動態(tài)平衡狀態(tài)（見圖3b）。

圖3 DP 9極限糊精的幾何優(yōu)化構(gòu)象（a）、極限糊精與淀粉片段相互作用的分子動力學(xué)模擬構(gòu)象圖（b）及回生的淀粉片段模型（c）Fig.3 Geometry optimization conformations of the limit dextrin （a）；One of the possible conformations corresponding to interaction of starch fractions with the limit dsextrin（b）；c，Conformation corresponding totheretrogradatedstarchfraction（c）

圖4 預(yù)先優(yōu)化的構(gòu)象模擬加熱到90℃并在90℃平衡1 ps的總能量、勢能和模擬溫度的曲線（a）及從90℃到4℃降溫模擬3 ps的總能量、勢能和模擬溫度的曲線（b）Fig.4 Curvesoftotalenergy，potentialenergy，and simulation temperature during the heating simulation performed to 90℃in 1 ps and the simulation at 90 ℃ in 1 ps，based on the preoptimized conformation （a） and Curves of total energy，potential energy，and simulation temperature during the cooling simulation performed from 90 ℃ to 4 ℃ in 3 ps（b）

由表2可知，經(jīng)分子動力學(xué)模擬后，對照淀粉片段與添加極限糊精的淀粉片段相比，對照淀粉片段回生后體積（ΔMV）和表面積（ΔSA）有很大的減小，說明糊化的淀粉片段從無序態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛行虻碾p螺旋結(jié)構(gòu)（見圖3c）。這個實驗結(jié)果可以用Tian等[16]研究結(jié)果解釋，在低溫下聚合物會轉(zhuǎn)變成為有序構(gòu)象。Hyperchem 8.0軟件的單點能工具模塊計算得到的主要非鍵合相互作用（氫鍵能、范德華能和勢能）結(jié)果見表2（表2中“-”號表示作用力的方向）。其中，氫鍵能（ΔEHB）的變化最大，據(jù)此可判斷氫鍵的相互作用是導(dǎo)致淀粉片段體積和表面積變化的主要作用力，這與Sasaki和Matsuki的報道相一致[17]。從表2中也可看出，范德華作用（ΔEVdW）是導(dǎo)致淀粉片段體積和表面積變化的另外一個重要因素，這是因為范德華作用力是聚合物重結(jié)晶的重要驅(qū)動力之一[18]。然而勢能（ΔEEF）同氫鍵作用或范德華作用相比，勢能變化在淀粉片段結(jié)構(gòu)有序化過程中作用有限。因此，由分子動力學(xué)模擬結(jié)果可以得出結(jié)論：DP 9的極限糊精可以抑制淀粉片段的結(jié)構(gòu)有序化，這與本研究WXRD和DSC的測試結(jié)果一致。

表2 淀粉片段的結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化及非鍵合相互作用參數(shù)Table 2 Changes of structure properties and non-bonded interaction energy of starch fractions

3 結(jié)語

本研究通過WXRD和DSC技術(shù)手段證實極限糊精顯著影響小麥淀粉回生的速率和程度。而Avrami方程指數(shù)說明小麥淀粉回生成核維數(shù)為一維成核。分子動力學(xué)模擬結(jié)果除印證WXRD和DSC實驗結(jié)果之外，還說明極限糊精抑制小麥淀粉回生主要通過極限糊精與淀粉片段之間的氫鍵和范德華作用阻礙淀粉片段的有序化進(jìn)程。作者旨在了解極限糊精影響淀粉回生，在此基礎(chǔ)上為α淀粉酶抑制淀粉回生的機理提供一定的參考依據(jù)。

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