黃碧蘭 張玄兵 范紅霞

摘 要 利用根尖壓片法對懸鈴花進行核型分析。結(jié)果表明：懸鈴花體細胞的染色體數(shù)為2n=28， 相對長度系數(shù)組成為：2L+10M2+8M1+6S，核型不對稱系數(shù)為：59.95%；其核型公式為：20m+8sm，屬2B核型。為今后錦葵科懸鈴花屬植物核型分析研究提供一定的借鑒和依據(jù)。

關(guān)鍵詞 懸鈴花 ；染色體 ；核型分析

分類號 S68

懸鈴花，別名大紅袍、卷瓣朱槿、南美朱槿，屬常綠小灌木。往往逸為野生，華南地區(qū)多植于庭院。懸鈴花形似風鈴，美麗可愛，為不可多得的盆栽佳品，也是園林造景中常用的灌木植物，形態(tài)優(yōu)美，花色艷麗，花期較長，具有極高的觀賞價值。染色體是生物遺傳物質(zhì)的載體，染色體數(shù)目及形態(tài)結(jié)構(gòu)反映了一個物種的基本特征。植物染色體核型分析對于研究植物的系統(tǒng)演化、起源、物種間親緣關(guān)系及遠緣雜交等方面都有著重要的意義。從目前研究狀況來看，國內(nèi)外對懸鈴花的染色體核型研究尚未見報道。為此，本文以懸鈴花為研究對象，通過懸鈴花染色體核型分析，探索懸鈴花的細胞遺傳特征，為懸鈴花的分類、雜交育種、品種改良提供細胞學基礎和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以栽培懸鈴花作為研究對象，溫室栽培，室內(nèi)處理。早上8：00～10：00溫室取材。

1.2 方法

以常規(guī)壓片法制備染色體標本，以李懋學，陳瑞陽[1]的核型分析方法為參照標準進行核型分析。

1.2.1 取材

等懸鈴花花的根長至1.0～1.5 cm 時，選取飽滿、健壯的根尖，截取2～3 mm。

1.2.2 預處理

預處理的目的是阻止或破壞紡垂體微管的形成，累計比較多的處于細胞分裂中期的染色體圖象。同時促進染色體濃縮變短、改變胞質(zhì)粘度，促進染色體清晰及細胞質(zhì)清潔，便于觀察。所以預處理是否適宜，是染色體制片技術(shù)中最關(guān)鍵的操作步驟。本試驗采用了0.002～0.004 mol/L的8羥基處理的方法，處理時間為2～3 h[2-4]。

1.2.3 固定

預處理后將根尖用蒸餾水清洗干凈后轉(zhuǎn)入改良的卡諾氏固定液。用卡諾氏固定液（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）置4℃或常溫對材料處理2～24 h[5-7]。

1.2.4 解離

采用酸解法，將固定好的材料用蒸餾水清洗10 min，解離液用1 mol/L 鹽酸在（60±1）℃水浴鍋內(nèi)預熱5～10 min[8-9]。

1.2.5 染色

將解離好的根尖用蒸餾水沖洗凈后就可進行染色了，在洗滌時一定要將材料中殘留的鹽酸溶液徹底清洗干凈，否則不利于染色。染色劑選用卡寶品紅染液，染色時間為12、24、36 h，最后確定染色效果最好的時間。

1.2.6 制片

采用常規(guī)壓片法進行制片。用鑷子夾取一個根尖放置在載玻片上，然后滴上一滴45%的醋酸，蓋上蓋玻片，用鑷子輕輕敲打蓋玻片，使細胞和染色體分散開來[9]。敲完后再放酒精燈上微熱5～10 s，最后再輕壓一下玻片。壓片時要注意控制力度不要敲碎蓋玻片，同時要保證蓋玻片和載玻片不發(fā)生滑動。

1.2.7 鏡檢

在顯微鏡下觀察制片，選擇染色體分散較好的細胞進行染色體數(shù)目統(tǒng)計，并且拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 預處理效果

實驗表明，用0.002 mol/ L 的8-羥基喹啉水溶液處理懸鈴花根尖材料2.0 h ，在流動的自來水中處理并不斷振蕩，期間更換一次新鮮溶液，這樣的制片效果比較好，可以得到較多染色體形態(tài)清晰、收縮較好的中期分裂相細胞。

2.2 固定時間

實驗表明，用改良的卡諾氏固定液固定24 h，可以更清楚的表現(xiàn)出染色體的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

2.3 解離時間

實驗表明，用0.002 mol/L 8羥基喹啉水溶液處理根尖2.0 h后，用改良的卡諾氏固定液固定24 h，再在（60±1）℃水浴鍋內(nèi)解離10 min，根尖軟化程度較好，壓片時細胞易分散，染色體形態(tài)自然，細胞背景清晰。解離5 min ，根尖軟化程度不夠，細胞難以壓散，觀察時不夠清晰；解離15 min以上，材料又過度軟化，細胞容易被壓碎，壓片時常造成染色體丟失，不便于統(tǒng)計。

2.4 染色效果

卡寶品紅對染色體的染色效果，與鹽酸的解離條件密切相關(guān)，不同的植物需要不同的解離條件。實驗表明。將懸鈴花根尖材料在（60±1）℃水浴鍋內(nèi)解離10 min后染色，效果較好，這時染色體呈紫紅色，細胞質(zhì)無色或只有極淡的紅色。

2.5 制片效果

實驗表明，蓋蓋玻片時應傾斜下放，盡量不留氣泡在蓋片內(nèi)。敲片時用力要均勻、適度，以防敲碎蓋玻片。壓片時手的力氣要朝一個方向，這樣的制片染色體比較分散且無重疊現(xiàn)象，易于觀察。

2.6 鏡檢過程

實驗表明，在鏡檢過程中先用20倍鏡觀察，看到比較清晰的后轉(zhuǎn)入40倍鏡，最后用100倍的油鏡拍照。在整個過程中，用100倍鏡滴香柏油時需特別小心，用量要少，防止香柏油進入玻片內(nèi)沖走染色體。

通過AutoCAD 2004 Chs、Adobe Photoshop CS、Microsoft Excel、Microsoft Word等軟件及工具得出數(shù)據(jù)和圖。見表1和圖1、2、3。

由表1可得出以下結(jié)論：

（1）染色體數(shù)目：2n=2x=28

（2）核型公式：20m+8sm

（3）相對長度系數(shù)組成為：2L+10M2+8M1+6S

（4）核型不對稱系數(shù)為：59.95%

（5）最長染色體/最短染色體之比為：2.171

（6）臂比大于2 的染色體比例為：0.071

（7）細胞類型為：2B

2.7 核型的組成

選取2個染色體分散較好、形態(tài)較清晰的懸鈴花中期染色體分裂相細胞進行核型分析。懸鈴花的核型模式見圖1，懸鈴花染色體的模式照片見圖2。結(jié)果表明，懸鈴花體細胞的染色體數(shù)為2n=28。在懸鈴花的14對染色體中，具近中部著絲點4對；具中部著絲點10對。其核型公式為：20m+8sm，其核型圖見圖3。

2.8 核型類型

懸鈴花的最長染色體/最短染色體之比是2.171，因此根據(jù)Stebbins[10]的劃分標準可以得出：懸鈴花的細胞類型為2B

2.9 染色體相對長度系數(shù)組成

根據(jù)染色體相對長度系數(shù)（Index of relative length， I. R. L），I.R.L=染色體長度/全組染色體平均長度組成劃分[11]，即I.R.L≥1.26為長染色體（L）；1.01≤I.R.L≤1.25為中長染色體（M2）；0.76≤I.R.L≤1.00為中短染色體（M1）；I.R.L<0.76為短染色體（S）。由此可得懸鈴花有1對長染色體，5對中長染色體，4對中短染色體和3對短染色體。

2.10 核型不對稱系數(shù)

核型不對稱系數(shù)[A sk=（長臂總長/全組染色體總長）×100%]，其比值愈大愈不對稱。本實驗測得懸鈴花的染色體核型不對稱系數(shù)為59.95，比較對稱。

研究證明，高等植物核型進化的基本趨勢是由對稱向不對稱發(fā)展，系統(tǒng)演化上處于比較古老或原始的植物，往往具有較對稱的核型，而不對稱的核型則通常出現(xiàn)在較進化或較特化的植物中。按Stebbins劃分標準，1A最對稱，4C最不對稱。根據(jù)這個觀點，懸鈴花為2B，應該屬于較對稱核型，實驗證明亦是如此。由此可見，懸鈴花在同屬植物中屬于相對原始的植物。

3 結(jié)論與討論

實驗結(jié)果表明：根尖取樣以早上8：00～10：00溫室取材為佳，切取根尖2～3 mm，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉預處理2 h（處理期間振蕩指形管更換一次溶液并置于流動的自來水中），用改良的卡諾氏固定液固定24 h，用1 mol/L HCL在（60±1）℃水浴鍋中解離10 min，用卡寶品紅染色24 h，效果較好。結(jié)果顯示：懸鈴花體細胞的染色體數(shù)為2n=28；相對長度系數(shù)組成為：2L+10M2+8M1+6S；核型不對稱系數(shù)為：59.95%；其核型公式為：20m+8sm，細胞類型為2B。Levitsky[12]、Stebbins[13]曾指出，在系統(tǒng)演化上，處于較古老的或原始的植物具有對稱的核型，而不對稱核型往往出現(xiàn)在進化水平較高或特化的植物中，親緣關(guān)系比較近的物種往往具有較相似的核型。所以懸鈴花在核型進化上應屬于較原始的核型類型。已有研究表明，生物的進化是復雜的、多方向和多樣化的，在已知的某些科、屬內(nèi)，核型并不完全表現(xiàn)為由對稱向不對稱進化，而有可能表現(xiàn)為由不對稱向?qū)ΨQ進化[14]。懸鈴花植物的進化屬于何種，有待于進一步的研究。

參考文獻

[1] 李懋學，陳瑞陽. 關(guān)于植物核型分析的標準化問題[J]. 武漢植物學研究，1985（04）：297-302.

[2] 任 琛，孫景景，袁 瓊. 蟛蜞菊屬和孿花菊屬（菊科——向日葵族）的細胞學研究[J]. 熱帶亞熱帶植物學報，2012，20（2）：107-113.

[3] 時麗冉，王 晶，崔興國. 紫穗槐核型分析方法的探討[J]. 北方園藝，2009（2）：53-55.

[4] 王 勝，張春發(fā)，鄧柳紅. 紫萬年青的核型分析[J]. 基因組學與應用生物學，2010，29（2）：327-331.

[5] 丁 鴻，邱東萍，陳少雄. 植物染色體標本的制備和染色體核型分析研究進展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，2012，43 （12）：1 958-1 962.

[6] 林秀琴，蔡 青，陸 鑫. 甘蔗根尖染色體制片技術(shù)研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2011（27）：104-108.

[7] 詹秋文，高 麗，張?zhí)煺? 蘇丹草與高粱染色體核型比較研究[J]. 草業(yè)學報，2006，15（2）：100-106.

[8] 李娟娟，王 蕾，賈俊忠. 黃瓜正常品種及一個芽黃突變體的核型分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（2）：296-300.

[9] 鄧果特. 中國芒屬植物染色體核型與倍性研究[D]. 湖南農(nóng)業(yè)大學，2012

[10] 洪德元. 植物分類學[M]. 北京：科學出版社，1990，30.

[11] 鄭金雙，張蜀寧，孫成振. 不結(jié)球白菜根尖體細胞染色體制片及其二倍體和四倍體有絲分裂過程觀察[J]. 植物資源與環(huán)境學報，2011，20（4）：58-63.

[12] Arano H. Gytological studies in subfamily Carduoideae （Compositaeof Japan IX[J]. BotMag （Tokyo），1963（76）： 32-39.

[13] Stebbins G L. Chromosomal Evolution in Higher Plants[M]. London： Edward Arnold L TD， 1971： 85-105.

[14] 冷青云，莫 饒. 三褶蝦脊蘭的核型分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學報，2008，16（2）：165-168.